正交試驗法優選金貝化痰顆粒中黃芩苷的提取工藝

楊曉日 姜慧禎 張 力 王軍棟 顧家琿 杜麗君 孫麗鳳▲ 孫琦雅.山東省煙臺市中醫醫院藥劑科，山東煙臺 64000；.山東省煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東煙臺 64003

金貝化痰湯劑是煙臺市中醫醫院的臨床經驗方，由瓜蔞、黃芩、法半夏、浙貝母、炙麻黃、苦杏仁、桔梗、金銀花、連翹等中藥組成。 臨床上用來治療慢性阻塞性肺疾病、肺炎、支氣管擴張、急性支氣管炎等呼吸系統疾病、證屬痰熱蘊肺證[1-5]，臨床實踐多年，療效顯著。但是由于傳統湯劑存在保存期短、易發霉變質、服用劑量大等缺點，為了克服以上缺點，同時也為了更好地提高療效，有效地控制生產質量，課題組擬將其研制成顆粒制劑，即金貝化痰顆粒[6-8]。 本實驗對金貝化痰顆粒中黃芩苷的提取工藝進行優化研究，根據傳統制備工藝結合煙臺市中醫醫院制劑室生產的實際情況采用水提取工藝，以金貝化痰湯劑處方的出膏率和處方中君藥黃芩的有效成分黃芩苷的提取率為指標[9-10]，優選金貝化痰顆粒的最優水提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器及試劑

1260 Infinit Ⅱ高效液相色譜（安捷倫科技有限公司）；KEJ-1000 超聲波清洗機（張家港科凈超聲洗凈設備有限公司）；SHB-Ⅲ型水循環多用真空泵（上海亞榮有限公司）；EL-204 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DHG-9070A 型電熱恒溫水浴鍋（江蘇常熟醫療器械廠）；電熱干燥箱（上海一恒實驗儀器總廠）。

黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，批號為1100715-201318）；甲醇（色譜純，美國TEDIA 公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 試藥

依據2015 版 《中華人民共和國藥典》（一部）[11]，測定處方藥材的有效成分含量，結果見表1。 結果顯示，處方藥材的有效成分含量測定結果全部合格。

表1 藥材含量測定結果

2 方法與結果

2.1 黃芩苷含量的測定

2.1.1 色譜條件 1260 Infinit Ⅱ高效液相色譜；色譜柱：Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以甲醇:水:醋酸溶液（47∶53∶0.2）為流動相；檢測波長為280 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為25℃。 在此色譜條件下，黃芩苷與相鄰色譜峰的分離度為6.6； 理論板數按黃芩苷峰計算不低于2500。 陰性對照色譜對測定無干擾。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃芩苷對照品，在60℃減壓干燥4 h， 加甲醇制成60.9 μg/ml 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 金貝化痰湯劑的處方為：瓜蔞6 g，黃芩4 g，法半夏4 g，浙貝母4 g，炙麻黃3 g，前胡3 g，金銀花8 g，連翹3 g，蘆根5 g，紫蘇葉3 g，蜜枇杷葉3 g，苦杏仁3 g，桔梗4 g，厚樸3 g，桃仁3 g，生姜4 g，大棗3 g，甘草2 g。 按處方比例稱取藥材68 g，按實驗設計表加入水進行回流提取，用水定容至1000 ml 搖勻，取75 ml 提取液水浴蒸干，殘渣加70%的乙醇40 ml 回流提取3 h， 提取液用70%的乙醇定容至100 ml 搖勻，取1 ml 用70%的甲醇定容至10 ml，搖至均勻，以0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 空白溶液的制備 稱取處方中除黃芩外的其余藥材，用8 倍量水回流提取2 次，每次1 h，合并兩次提取液，加水定容至1000 ml，搖勻，過0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。

2.2 線性關系考察

分別精密吸取203 μg/ml 黃芩苷貯備液各0.2、1、1.2、2、3 ml 至10 ml 量瓶中，稀釋后得對照品溶液，按照“2.1.1”項下方法進樣10 μl 進行色譜測定，得到峰面積。 以對照品的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標， 得到回歸方程和相關系數：Y=11.859X-14.98，r2=0.9993，黃芩苷在4.06～24.36 mg/ml 范圍內線性關系良好。

2.3 空白試驗

取“2.1.4”項下的黃芩空白溶液、“2.1.2”項下的黃芩苷對照品溶液、“2.1.3”項下的供試品溶液各10 μl，按照“2.1.1”項下條件進樣10 μl 進行色譜測定，色譜圖結果見圖1。 結果顯示，供試品溶液、黃芩苷對照品溶液均在7 min 左右出現了黃芩苷特征吸收峰，黃芩空白溶液則在此處無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 黃芩高效液相色譜圖

2.4 穩定性試驗

取“2.1.3”項下供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1.1”項下條件進樣10 μl 注入高效液相色譜儀進行色譜測定，測得峰面積，其峰面積平均值為60.307，其RSD 為2.25%（n=6）。 結果表明，供試品溶液在24 h 內基本穩定。

2.5 重復性試驗

取“2.1.3”項下同一供試品6 份各10 μl，按照“2.1.1”項下條件進樣10 μl 進行色譜測定，得到黃芩苷含量，其RSD 為0.5%（n=6）。

2.6 精密度試驗

取“2.1.2”項下的黃芩苷對照品溶液，按照“2.1.1”項下條件進樣10 μl 進行色譜測定，連續進樣5 次，測定峰面積，計算平均峰面積為696.114，其RSD 為0.06%（n=5）。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品，共5 份，精密稱定，各加入黃芩苷對照品0.95 mg，按照“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，按照“2.1.1”項下條件進樣10 μl 進行色譜測定，依次測定各份樣品中黃芩苷的含量，結果見表2。結果顯示，平均加樣回收率為99.80%，其RSD 為1.05%。

表2 黃芩苷加樣回收率試驗結果

2.8 出膏率的測定

精密量取“2.1.3”項下供試品溶液25 ml 置蒸發皿（已干燥至恒重）中，100℃水浴蒸干后，置于105℃干燥箱中干燥3 h，再移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，得到出膏率。其中出膏率＝干膏質量（g）/藥材總質量（g）×100%[12]。

2.9 提取工藝優選

2.9.1 單因素分析與正交試驗設計 參考文獻[13-17]，影響提取的因素有提取時間、提取次數、溶媒及用量等，以黃芩苷含量為指標，采用回流提取法提取，進行單因素考察，取處方量藥材，分別加入4、6、8、10、12 倍水，回流提取2 次，每次1 h，結果顯示，超過10 倍水量后黃芩苷含量不再增加；取處方量藥材，加入10 倍水，分別回流提取1、2、3、4 次，每次1 h，結果顯示，提取次數超過3 次后黃芩苷含量增加不明顯。取處方量藥材，加入10 倍水，回流提取3 次，提取時間每次分別1、1.5、2、3 h，結果顯示，當超過2 h 后黃芩苷含量增加不明顯。

2.9.2 提取工藝優選 在單因素試驗結果的基礎上設計正交試驗，選取提取時間、提取倍數和提取次數作為考察因素，毎個因素選取3 個水平，以黃芩苷轉移率（黃芩苷轉移率＝提取液中指標成分含量/藥材中指標成分含量×100%）和出膏率為評價指標，選用L9（34）正交表安排試驗，對多指標進行綜合評價，黃芩苷轉移率和出膏率的權重系數分別占0.5。 因素水平見表3，L9（34）正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

表3 因素水平表

對試驗結果進行直觀分析，表4 中R 值的大小提示各因素對綜合評分的影響大小依次均為： 提取次數（因素C）＞提取時間（因素B）＞加水量（因素A）。由表5 方差分析結果可知，提取次數（因素C）對綜合評分的影響有統計學意義（P＜0.05），而加水倍量（A）和提取時間（B）的影響則差異無統計學意義（P＞0.05），結合表4 中K 值大小，因素A 加水量選擇K3，因素B 提取時間選擇K3， 因素C 提取次數選擇K3，因此，最優工藝確定為A3B3C3，即加10 倍量水，每次2 h，提取3 次。

表4 L9（34）正交試驗結果

表5 方差分析結果

2.10 最佳工藝驗證試驗

按照分析的最佳工藝（加10 倍量水，每次2 h，提取3 次）進行驗證試驗，結果見表6。 驗證試驗結果顯示，最佳工藝中黃芩苷的平均轉移率為78.96%，RSD為4.035%； 平均出膏率為47.48%，RSD 為1.11%，提示此提取工藝穩定可行。

表6 最佳工藝驗證試驗結果

3 討論

合理地選擇中藥處方的提取工藝及指標是保證原方藥效的關鍵。黃芩為金貝化痰顆粒處方的君藥，主要成分黃芩苷具有抗病原微生物、解熱、抗炎、抗菌等多種生理活性和藥理作用[18-20]。 故選中藥處方常用的出膏率和黃芩的有效成分黃芩苷的轉移率作為考察指標，篩選金貝化痰顆粒中黃芩苷的最優提取工藝。

測定黃芩苷時，筆者對不同廠家、不同類型的C18柱進行了考察，結果顯示，用Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）時，黃芩苷的峰形和分離度良好。故本實驗選擇用Agilent EC-C18柱。同時在選擇流動相時，參照藥典法的流動相甲醇:水:醋酸溶液（47∶53∶0.2），試驗結果顯示，黃芩苷的峰形和分離度良好。 故選擇甲醇:水:醋酸溶液（47∶53∶0.2）為流動相。

本文采用L9（34）正交試驗考察提取工藝黃芩苷提取率的影響， 以高效液相色譜法對黃芩苷的含量進行檢測，綜合生產、經濟等因素，優選最佳提取工藝。 結果顯示金貝化痰顆粒中黃芩苷的最優水提取工藝為加入10 倍量水，提取3 次，每次2 h。 并經驗證此提取工藝穩定可行，方法操作簡便、有效，可為下一步的金貝化痰顆粒的成型工藝和質量標準研究提供依據。