慢性丙肝患者血清半乳糖凝集素-4 和白細胞介素-27 的表達變化分析

許海波，江羅佳，吳錦瑜

（江西省九江市第一人民醫院1.肝病科；2.腎內科，九江 332000）

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus ，HCV）感染是一種常見感染性疾病，全世界有超過1.775 億患者[1]。 丙型肝炎病毒感染可發展為肝硬化和肝細胞癌， 迫切需要有效的早期抗病毒藥物來阻止不良預后的發生[2]。 根據免疫和病毒之間的平衡尋找標志物或可用于判斷患者預后的結局。 半乳糖凝集素是一類聚糖結合蛋白或凝集素，可識別細胞表面大量N-乙酰乳糖胺殘基[3-4]。 其中半乳糖凝集素-4（GAL4）在控制腸道炎癥和促進腸道炎癥方面具有雙重作用[5]。 此外，在乙型肝炎病毒感染患者中觀察到其顯著升高， 表明其可能參與了肝臟炎癥反應[6]。 免疫調節性的細胞因子可影響HCV 慢性感染的進展和肝損傷程度。 其中， 白細胞介素-27（IL-27） 是活化的抗原呈遞細胞釋放的白細胞介素-6/白細胞介素-12 家族細胞因子之一[7]。 據報道，IL-27 在病毒感染中具有抗病毒和抗炎作用。但目前關于GAL4 和IL-27 是否在慢性丙肝患者中存在異常，是否與患者病毒載量存在關聯，并不清楚。 據此， 本研究將通過分析丙肝患者血清GAL4 和IL-27 的變化及其與臨床資料間的關系，找出丙肝疾病嚴重程度新型生物標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016 年5 月至2021 年3 月間于本院肝病科就診的慢性丙肝患者39 例為本研究的疾病組。 納入患者均為HCV RNA 和Anti-HCV 抗體陽性， 排除合并其他類型肝炎病毒感染的患者或伴有終末期肝病如失代償肝硬化、 肝衰竭和肝癌等患者。 排除采樣前接受過抗病毒治療或免疫治療的患者。 同時選取30 例同期性別和年齡匹配的健康人作為本研究的對照組。

1.2 方法 采集治療前的外周血液樣本6 mL。其中3 mL 于干燥管中， 室溫放置15 min，4000 rpm 20 min 離心分離血清，置于-80 ℃中保存備用，保存備用的標本應不超過2 年，采用同樣的試劑盒分3次檢測。用于酶聯免疫吸附試驗測定血清GAL4 和IL-27 的濃度。 另3 mL 于EDTA 抗凝管中， 用于PBMC 的提取（天津灝洋Ficoll 淋巴細胞分離液）。使用商業化的實時熒光定量PCR 檢測試劑盒（達安基因）對HCV RNA 進行定量檢測，檢測下限為2 log10 copies /mL。血清生化標志物使用日立7600全自動生化分析儀及配套試劑完成測定。 血清GAL4 和IL-27 的濃度采用Abcam 公司的GAL4酶聯免疫試劑盒（ab213785）和IL-27 酶聯免疫試劑盒（ab83695）加以測定，所有步驟嚴格參照試劑盒說明書執行。 PBMC 的提取及GAL4 和IL-27 的mRNA 水平測定：EDTA 抗凝全血與等體積PBS 混勻， 緩緩加入淋巴細胞分離液， 密度梯度離心（2000 rpm，30 min），收集中間層細胞即為PBMC。E.Z.N.A. Total RNA Kit II 提取PBMC RNA；Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA；SYBR@ Premix Ex TaqTM II 用 于Real time qPCR 反應， 所有實驗嚴格按照試劑盒說明書執行。 Real time qPCR 擴增程序：預變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，循環數為40，退火60 ℃30 s。選取GAPDH 為內參基因， 利用2-△△Ct法計 算Tim-3 mRNA 和Gal-9 mRNA 的相對含量。 引物序列，見表1。

表1 GAL4 和IL-27 的引物序列

1.3 統計學處理 統計學軟件SPSS 23.0 對本研究中的數據進行分析，數據用（±s）表示，兩組間差異采用獨立樣本t 檢驗比較。 GAL4 和IL-27 與臨床參數間的相關性行Spearman 相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性HCV 感染患者一般資料 分析發現，慢性HCV 感染者具有更高水平的ALT、AST 和ALP， 與健康對照組間的差異均具有統計學意義（P<0.05）；而相比對照組，HCV 感染者具有更低水平的PLT 和ALB（P<0.05）。此外，兩組人群間WBC并無顯著差異（P>0.05）。

2.2 慢性HCV 感染患者血清GAL4 和IL-27 及PBMC 中GAL4 mRNA 和IL-27 mRNA 對于血清游離的蛋白水平，ELISA 結果發現慢性HCV 感染患者血清GAL4 和IL-27 均顯著高于健康對照組人群， 差異具有統計學意義 （P<0.05）。 而對于PBMC 中GAL4 和IL-27 mRNA 水平， 熒光定量PCR 結果同樣發現慢性HCV 感染患者PBMC 中GAL4 和IL-27 mRNA 水平均顯著高于健康對照組人群，差異有統計學意義（P<0.05）。 見圖1。

圖1 慢性HCV 感染患者與健康對照組的GAL4 和IL-27 的表達變化

表2 慢性HCV 感染者與健康對照組的一般資料

2.3 GAL4 和IL-27 與臨床指標間的相關性分析分析發現血清GAL4 與AST 和HCV RNA 均呈顯著負相關性；GAL4 mRNA 與AST 和HCV RNA 呈顯著負相關性， 而與ALB 呈顯著正相關性。 血清IL-27 與HCV RNA 呈顯著負相關性，而與ALB 呈顯著正相關性；IL-27 mRNA 同樣與HCV RNA 呈顯著負相關性，而與ALB 呈顯著正相關性。 見表3。

表3 GAL4 和IL-27 與臨床指標間的相關性分析

3 討論

丙型肝炎是全球公共衛生問題之一。 使用利巴韋林的舊治療方案， 超過一半的治療患者用peg-IFN-α 不能持續清除病毒或避免慢性病毒感染的長期并發癥現象的發生[8]。 在慢性丙型肝炎中， 宿主免疫因素以及可促進免疫系統失調的HCV 相關蛋白的生物學效應構成了HCV 相關肝炎的免疫發病機制[9]。 從失衡的免疫系統中尋找某些異常表達的蛋白可能為發掘丙型肝炎患者疾病嚴重程度的生物標志物提供新的思路。 本研究旨在評估丙型肝炎患者血清GAL4 和IL-27 表達水平及其與病毒載量的相關性。 結果表明，與對照組相比， 丙型肝炎病毒組患者GAL4 的mRNA 表達水平和血清蛋白水平均顯著升高。 這可能是機體對肝臟炎癥所產生的反應，因為GAL4 具備獨特的抗炎特性。 據報道，GAL4 在腸道炎癥性疾病中可通過與活化的T 細胞表面CD3 結合， 進而增強T細胞凋亡或減少促炎細胞因子的分泌[10]。 然而，GAL4 是否在肝臟炎癥中發揮類似的抗炎機制需要進一步研究。 此外，在丙型肝炎病毒組中GAL4相對mRNA 表達水平和血清蛋白水平均與病毒載量之間存在高度負相關。這一發現表明GAL4 對丙型肝炎病毒可能具有抵抗作用， 這與其他種類的半乳糖凝集素在其他病毒感染中顯著上調的結果類似。 這些半乳糖凝集素可通過激活和增強免疫反應來進行抗病毒防御[11]。 如半乳糖凝集素-3 通過不同的機制在丙型肝炎病毒感染中產生抗病毒作用。 半乳糖凝集素-3 抑制丙型肝炎病毒對白細胞介素-6 的促炎反應，減少慢性炎癥[12]。 此外，半乳糖凝集素-3 還可以作為丙型肝炎肝硬化的預后標志[13]。 相反，半乳糖凝集素-9 卻可維持慢性丙型肝炎病毒感染， 其可通過誘導丙型肝炎病毒特異性T 細胞凋亡和增加抑制性Treg 細胞數量而抑制適應性免疫[14]。 當前研究表明GAL4 在丙型肝炎病毒感染中具有抗病毒作用， 但需要進一步的研究來探索其在抗丙肝病毒作用中的具體機制。 Cai 等[6]在HBV 感染患者中報告了類似的結果。 該研究認為GAL4 可減少促炎細胞因子分泌、誘導T 細胞凋亡來對抗肝臟炎癥的免疫反應。同樣，Kondoh 等[15]的研究顯示，與對照組相比，肝硬化丙型肝炎患者肝組織中GAL4 基因表達增加， 但仍低于HCC患者。

此外，本研究還顯示，與對照組相比，丙型肝炎病毒感染患者IL-27 水平也顯著升高，其與病毒載量之間同樣存在高度顯著的負相關性， 這些發現與Houssen 等的結果類似。該研究認為這些結果可能是因為IL-27 的抗病毒活性，IL-27 可以誘導一些抗病毒STAT1 依賴性基因， 并具有類似于干擾素-α 一樣的抗肝病毒感染的作用[16]。 因此，IL-27 與病毒載量呈現顯著負相關性， 其可能在丙型肝炎患者中發揮抗HCV 病毒效應，也可能成為反應患者病毒載量的新型生物標志物。 當前研究發現以前關于IL-27 的研究結果或可用IL-27 對T細胞和肝細胞的作用來解釋，即IL-27 誘導抗病毒Th1 細胞的合成； 此外，IL-27 與干擾素-α 通過誘導STAT1 依賴性基因阻斷Th17 細胞和iTreg 細胞分化具有相似的抗病毒機制[19]。 IL-27 可誘導STAT1 依賴途徑和STAT3 依賴途徑， 這兩種途徑均與病毒感染和肝臟病毒感染的HCC 進展有關，表明IL-27 可能作為病毒性肝炎的新型治療靶點[20]。未來的研究中將進一步評價IL-27 對丙肝病毒復制的影響及其對疾病結局的影響。

總之， 本研究初步證實在慢性丙肝患者中GAL4 和IL-27 均顯著升高，且與丙肝病毒載量密切相關，可能為慢性丙肝提供新的生物標志物。