丹瓜方對糖尿病大鼠視網膜組織MCP-1和NF-κB p65表達的影響

馮春燕，余鋨香，曹俊昌，林 琳，黃蘇萍，衡先培

（1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建福州 350003；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州 350122；3.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州 350004）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病導致的一種常見微血管疾病，其特征主要包括視網膜水腫、滲出、出血、新生血管及增殖膜改變等，臨床癥狀主要表現為視力進展性下降，甚至失明。流行病學數據顯示，DR 患病人數在糖尿病患者中的占比約為22.3%［1］。DR 患病率與致盲率目前呈現明顯的逐年上升的態勢，故探究DR 的病因病機與防治的形勢刻不容緩。恰如劉完素在《醫方精要宣明論》中所述：“消渴一證，可變為雀目或內障”，近代醫家將DR 歸屬于中醫學“消渴目病”或“消渴內障”范疇，病位主要在肺、脾、腎，病機主要是氣陰虧虛、脾腎兩虛、痰瘀阻絡［2］。丹瓜方是衡先培教授治療痰瘀互結型糖尿病及其并發癥的經驗方，前期臨床研究與動物實驗證明，該方具有調節糖脂代謝紊亂、抑制炎癥反應、調控氧化應激、改善糖尿病及其并發癥癥狀的功效［3-8］，但是其療效機制尚未完全明確，仍需深入探究。因此，本研究旨在觀察丹瓜方干預糖尿病大鼠視網膜組織中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）與核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達的變化，進一步探討丹瓜方防治DR 的作用機制，為課題的后續研究提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 13 周齡SPF 級自發性糖尿病（Goto-Kakisaki，GK）雄性大鼠40只，體質量309～412 g；Wistar 雄性大鼠10 只，體質量345～383 g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）20070005。置于福建中醫藥大學實驗動物中心飼養。

1.2 實驗藥物 丹瓜方藥物組成：丹參15 g，瓜蔞15 g，薤白10 g，川芎10 g，赤芍10 g，郁金10 g，法半夏6 g，白僵蠶6 g，均購自福建中醫藥大學附屬人民醫院藥劑科。鹽酸二甲雙胍片（上海信誼藥廠有限公司，生產批號：091226B）；辛伐他汀片（廣州南欣制藥有限公司，生產批號：2117091）。

1.3 實驗試劑 MCP-1 抗體（博士德生物工程有限公司）；NF-κB p65 抗體（美國CST 公司）；小鼠GAPDH 抗體（上海康成生物工程有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠（上海碧云天生物技術有限公司）；胰蛋白酶（美國BD 醫療器械有限公司）；破膜劑（美國Caltag 公司）。

1.4 實驗儀器 培養板、低溫高速離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）；PVDF 膜（德國Millipore 公司）；ELX808 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；Model 680 及電泳凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；電泳儀和電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 大鼠自由攝食飲水，適應性飼養2 周后，測量記錄每只大鼠空腹狀態下體質量，并檢測所有大鼠的尾靜脈隨機血糖。非同一日內測2次每只GK 大鼠空腹血糖均≥11.1 mmol/L，40只成年雄性GK 大鼠均為糖尿病模型大鼠［4］。Wistar大鼠組隨機血糖4.6～6.0 mmol/L。采用隨機數字表法將GK 大鼠分為模型組、二甲雙胍組、辛伐他汀組、丹瓜方組，每組10 只，Wistar 大鼠作為正常組。

2.2 藥物干預 二甲雙胍組按125 mg/（kg·d）予二甲雙胍懸濁液灌胃，辛伐他汀組按1.7 mg/（kg·d）予辛伐他汀懸濁液灌胃，丹瓜方組按6.7 mg/（kg·d）予丹瓜方懸濁液灌胃，正常組與模型組予同體積無菌蒸餾水灌胃，各組每日9時灌胃，連續灌胃3個月。

2.3 Western blot 法檢測大鼠視網膜組織MCP-1 和NF-κB p65 蛋白表達 各組干預3 個月后剪取大鼠視網膜組織至研缽中，加入液氮，快速研磨至粉末，經RIPA裂解液裂解，4 ℃、12 000 r/min下離心5 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度。配制分離膠、濃縮膠制成凝膠，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液后上樣，進行凝膠電泳、轉膜。轉膜結束后，快速取出PVDF 膜，TBST 洗滌5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。取出膜，于搖床上TBST 洗膜5 min×3 次。孵育袋中加入TBST 稀釋的MCP-1（1∶400）、NF-κB p65（1∶1 000）和小鼠抗GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜5 min×3 次，加辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔（1∶2 000）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠（1∶2 000），室溫孵育2 h。TBST 洗膜5 min×3 次，置于化學發光檢測試劑（試劑A∶試劑B＝1∶1）反應2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF 膜，暗室中用X 膠片感光、顯影、定影。

2.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料符合正態分布以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結 果

與正常組比較，模型組視網膜組織MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、辛伐他汀組和丹瓜方組MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達均顯著下降（P＜0.01），見表1、圖1。

表1 5組視網膜組織MCP-1和NF-κB p65表達比較（xˉ±s）

圖1 5 組大鼠視網膜組織MCP-1 和NF-κB p65 蛋白電泳圖

3 討 論

糖尿病性微血管病變是糖尿病的特異性并發癥，常在糖尿病病程長和血糖控制不良的患者身上發現。消渴日久極易生痰、生瘀，痰瘀互結導致血行不暢，血脈瘀滯于眼底脈絡，神光不能發越，故見視物模糊癥狀；另一方面，痰瘀阻滯脈絡所致血行不暢、津液疏布失調，則消渴病變更甚。由此可見，消渴病與痰、瘀相互影響，痰、瘀會隨著消渴病的發展而產生，而隨著痰、瘀的加重，又會反過來使消渴病進一步發展，產生糖尿病微血管病變［9］。

丹瓜方由瓜蔞薤白半夏湯合新四物湯方化裁而來，方中丹參、川芎、赤芍、郁金等藥物活血祛瘀，瓜蔞、法半夏、薤白、白僵蠶等藥物化痰散結，活血祛瘀、化痰散結則血行通暢，津液輸布正常，從而使病情得到控制。根據前期的臨床研究，丹瓜方具有降低血糖、改善血液黏稠度的作用［10］，因此，重視“祛瘀化痰”法在治療消渴內障方面具有重要的臨床意義。

MCP-1 也稱為趨化因子，來自趨化因子CC 亞家族，是最早發現和研究最廣泛的CC 趨化因子。在糖尿病的病程中，因為長期血糖控制不佳、血糖偏高所形成的糖基化終末產物（AGEs）及糖尿病狀態均可使MCP-1 表達顯著增加，MCP-1 刺激炎癥產生加重動脈硬化的形成。大量研究已經證明，MCP-1 具有調節動脈平滑肌細胞增殖和誘導視網膜新生血管的能力，故MCP-1 被認為是導致糖尿病血管并發癥的一個危險因子［11-14］。NF-κB 是一個轉錄因子家族，可在疾病中控制多個細胞過程，包括炎癥、增殖、血管生成等。NF-κB 可被糖尿病激活，隨著NF-κB 的激活可使AGEs 的產生增加，并可使黏附分子的表達增加，使單核細胞與血管內皮細胞黏附，進而使血管硬化［15］。其中，由p65 亞單位形成的NF-κB p65 是目前研究發現的NF-κB 中作用最主要、分布最廣泛的組合形式，它參與機體免疫和炎癥反應，調節細胞凋亡、應激反應。KOWLURU 等［16］研 究發 現由Ras 相 關的C3 肉 毒素 底物1（Rac1）介導的視網膜中的NADPH 氧化酶2（Nox2）激活是糖尿病視網膜病變發病機制的早期事件，它導致線粒體損傷和毛細血管細胞凋亡的啟動。Rac1啟動子的結合位點之一是NF-κB，視網膜微血管系統中NF-κB 的p65 亞基與Rac1 啟動子的結合增加，導致Rac1 激活Nox2，由此可見NF-κB p65 是糖尿病視網膜病變的發生的因素之一［16-17］。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組視網膜組織MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達顯著提高（P＜0.01），說明MCP-1 和NF-κB p65 可能是DR 的影響因子，MCP-1 和NF-κB p65 可能與DR 的發生、發展密切相關。與模型組比較，二甲雙胍組、辛伐他汀組和丹瓜方組MCP-1、NF-κB p65 蛋白表達均顯著下降（P＜0.01），提示丹瓜方能有效改善糖脂代謝及預防視網膜動脈硬化的作用。綜上所述，丹瓜方可用于預防糖尿病患者并發DR，通過祛瘀化痰法治療消渴內障方面具有重要的臨床意義。