蓮心堿體外吸收對Ang Ⅱ誘導血管平滑肌細胞表型轉化的影響

賈沛芝，林 珊，2，曾建偉，2，熊曉滿，劉 菲，王美玲，林 煒，2，陳達鑫，2*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122）

高血壓是常見病之一，全國調查發現，近年來我國成人高血壓患病率逐年上升［1］。高血壓引起的主要靶器官損害為血管、心臟、腦和腎臟損傷及其相關并發癥［2］，而血管的功能性病變伴隨著高血壓的發生和發展，幾乎是所有靶器官病理改變的使動環節。因此，對高血壓血管病變的早期防治和藥物開發，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。高血壓導致的血管病變包括血管內皮損傷和血管重構兩大方面。高血壓引起血管重構的原因之一是腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）激活引起的血管緊張素2（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）分泌異常時，血管平滑肌細胞（VSMCs）將發生增殖、遷移，由收縮型向合成型轉變的表型轉換，同時VSMCs 分泌胞外基質引起膠原增生，使動脈血管管腔內徑狹窄，血管壁厚增加，動脈僵硬，導致血管由功能性病變發展為結構上的病理改變。VSMCs 表型轉換在促進血管重構中發揮重要作用，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是最常用的表型轉換標志物，收縮型與合成型相比，收縮型α-SMA 的含量較高。高血壓與血管功能損傷互為因果［3］。

清達顆粒由陳可冀院士治療肝腎陰虛肝陽上亢型高血壓的經驗方清眩降壓湯化裁而來［4］，全方由黃芩、天麻、鉤藤、蓮子心組成，具有清熱瀉火、平肝潛陽的作用。其中的蓮子心（Nelumbinis Plumula）是睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）成熟種子中的干燥幼葉及胚根，性寒、味苦，歸心、腎經，可平上亢之肝陽。《本草再新》中記載蓮子心有“清心火、平肝火、瀉脾火、降肺火。消暑除煩，生津止渴，治目紅腫”的功效。蓮子心的主要活性組分是蓮子心生物堿，包括蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心季銨堿、荷葉堿和原荷葉堿等。現代藥理研究表明，蓮子心及其生物堿類成分具有降低血壓、抗心律失常等作用［5］。蓮心堿是蓮子心中主要的雙苯異喹啉類生物堿之一，具有抗癌、抗高血壓、抗心律失常、抗氧化和抗炎等作用［6］。由于蓮心堿水溶性不高，是否能通過磷脂雙分子層進入細胞發揮其生物學作用的研究甚少。為了確定蓮心堿的作用途徑并進一步討論蓮心堿對高血壓血管功能的保護作用，本研究通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）法測定不同濃度蓮心堿進入A7R5 細胞的含量，并通過建立Ang Ⅱ誘導的A7R5 細胞表型轉換模型，觀察蓮心堿對細胞表型轉換的影響，為進一步闡述蓮心堿治療高血壓及靶器官損害的作用機制奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 大鼠胸大動脈平滑肌細胞（A7R5），購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CL-0316。

1.2 實驗儀器 Q-TOF/MS 飛行時間質譜（德國布魯克公司）；Agilent1290 UPLC 超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；雙轉盤活細胞共聚焦實時成像分析系統（美國PerkinElmer 公司）；AR2130 電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；CP225D 電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-300DB 臺式數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；自動細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；Infinite200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；倒置顯微鏡（日本尼康公司）；熒光倒置顯微鏡系統（德國徠卡儀器公司）。

1.3 實驗試藥 蓮心堿（C37H42N2O6）、MTT、臺盼藍染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：SL8100、M8180-250、C0040-100ML）；DMEM-高糖培養基、胎牛血清、雙抗、胰酶、PBS（美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：C11995500BT、10099-141、SV30010、25200072、SH30256.01B）；α-SMA 抗體（美國CST 公司，貨號：D4K9N）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?647）預吸附二抗（英國Abcam公司，貨號：ab150083）；乙腈（色譜純，德國MERCK 公司）；甲醇及甲酸均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養與傳代 A7R5 細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM 培養基置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，隔天更換培養液，待細胞處于對數生長期時用于實驗。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS 法測定蓮心堿進入細胞的含量 A7R5 細胞以1×105個/mL 的密度，接種于6 cm 培養皿中，每皿5 mL，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，吸取上清液，將細胞分為0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿組，分別加入含0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿的完全培養基，以0 μg/mL蓮心堿組作為空白對照，繼續孵育15 min 后消化收集細胞，經過5 次PBS 清洗，另收集200 μg/mL 蓮心堿組最后1 次清洗的PBS 溶液（蓮心堿PBS 清洗液）待測，考察經過清洗后的細胞外液中是否存在蓮心堿殘留；取50 μg/mL 的蓮心堿標準品溶液設為蓮心堿標準品組作為標準品對照。用甲醇破碎細胞膜，沉淀細胞結構，14 000 r/min 離心，棄沉淀，收集各組上清液為待測樣品。

UPLC-Q-TOF/MS分析應用Agilent 1290 Infinity UPLC系統和micro TOF Ⅱ檢測細胞內的蓮心堿含量。采用Agilent UPLC 300 Extend-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）分析。流動相由0.1%甲酸/水（流動相A）和乙腈（流動相B）組成，梯度程序為：洗脫液A 98%～98%，洗脫液B 2%～2%，洗脫時間為0～5 min；洗脫液A 98%～20%，洗脫液B 2%～80%，洗脫時間為5～30 min；洗脫液A 20%～2%，洗脫液B 80%～98%，洗脫時間為30～35 min，進樣量2 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃。質譜測定采用負離子模式，離子源電壓3.0 kV；干燥氣流速6.0 L/min；噴霧干燥機溫度180 ℃；掃描范圍78～1 800 m/z，Bruker Anglysis 系統對樣本進行檢測和鑒定。基峰色譜圖（BPC）顯示樣品或標準品中的成分。

2.3 MTT 法測定不同濃度蓮心堿對A7R5 細胞活力的影響 A7R5 細胞以1×105個/mL 的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h，吸取上清液，換成空白培養基孵育4h。吸去上清液后，將細胞分為0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿組，分別加入含0、5、25、50、100、200 μg/mL 蓮心堿的完全培養基，繼續孵育24 h 后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO）充分振蕩10 min 溶解結晶，用酶標儀在490 nm 處測定吸光度。

2.4 免疫熒光法檢測A7R5 細胞中α-SMA 的蛋白表達 將A7R5 細胞以5×104個/mL 的密度接種至20 mm 直徑的共聚焦小皿中，接種培養體系為1 mL，細胞搖勻后置于細胞培養箱中培養12 h。12 h 后吸去上清液，將細胞分為空白對照組（完全培養基）、Ang Ⅱ組（1×10-6mol/L Ang Ⅱ）、蓮心堿組（1×10-6mol/L Ang Ⅱ＋10 μg/mL 蓮心堿），繼續培養24 h 后，棄去皿中液體，PBS 清洗（5 min×3 次）。清洗后4%多聚甲醛固定20 min，棄上清，PBS 清洗（5 min×3 次）。使用0.1%Triton X-100 孵育5 min，棄液體，PBS 清洗（5 min×3 次）。之后每皿加入700 μL 封閉液，封閉1 h，封閉液中加入α-SMA 抗體（1∶100），4 ℃濕盒過夜。第2 天棄一抗，PBS 清洗（5 min×3 次）。結束后加入熒光二抗（封閉液1∶200 配置），避光常溫孵育1 h，棄二抗，PBS 清洗（5 min×3 次）。之后用即用型DAPI 染液染細胞核15 min，PBS 清洗（5 min×3 次），最后用PBS 浸泡細胞，雙轉盤活細胞共聚焦實時成像分析系統對α-SMA 表達與DAPI 的核定位照片進行疊加（Merge），觀察細胞表型轉換標志物α-SMA 的表達與分布情況。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件處理。計量資料符合正態分布以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析，若方差齊，采用T-test 法進行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Games-Howell 法進行兩兩比較。

3 結 果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS 法測定蓮心堿進入A7R5 細胞的含量 UPLC-Q-TOF/MS 法測定不同蓮心堿濃度干預組（0、5、25、50、100、200 μg/mL）、最高濃度蓮心堿干預組末次細胞清洗液及50 μg/mL蓮心堿標準品。結果顯示：測試樣品分子式分析C37H41N2O6得分為100，且出峰時間與蓮心堿標準品一致，確定細胞破碎后在14.0 min 時出現色譜峰為蓮心堿，見圖1。通過各組樣品的峰面積及峰高計算蓮心堿15 min 的進細胞效率。0 μg/mL蓮心堿組及蓮心堿PBS 清洗液組分析得出峰值為0，說明清洗細胞后細胞外無蓮心堿殘留，見圖2；進入細胞樣品率計算公式為：（50 μg 進細胞樣品峰面積/50 μg 標準品峰面積）×100%，結果顯示15 min 蓮心堿進細胞率為15.56%，見表1。根據測試樣品峰面積與蓮心堿濃度繪制曲線圖，結果顯示不同濃度蓮心堿進入細胞的含量與蓮心堿的濃度呈對數增長關系，說明蓮心堿濃度越高，進入細胞的含量越高且超過100 μg/mL后進入濃度飽和階段，見圖3。

圖1 UPLC-Q-TOF/MS 鑒定A7R5 細胞液中蓮心堿成分

圖2 UPLC-Q-TOF/MS 法檢測各組基礎峰色譜圖

表1 使用蓮心堿濃度及細胞內液成分的色譜峰表現

圖3 蓮心堿干預濃度與細胞內液成分峰值曲線圖

3.2 不同濃度蓮心堿對A7R5 細胞活力的影響 為觀察蓮心堿對A7R5細胞株的毒性，使用MTT法檢測不同濃度蓮心堿對細胞活力的影響。5、25、50 μg/mL蓮心堿組細胞活力與0 μg/mL 蓮心堿組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），100、200 μg/mL 蓮心堿組細胞活力較0 μg/mL 蓮心堿組明顯下降（P＜0.05），說明濃度為50 μg/mL 以下的蓮心堿在24 h內對A7R5 細胞活力不存在影響，見圖4。因此，選擇＜50 μg/mL 的蓮心堿濃度，可用于后續細胞實驗的研究。

圖4 不同濃度蓮心堿對A7R5 細胞活力的影響

3.3 蓮心堿對AngⅡ誘導A7R5 細胞α-SMA 的影響 與空白對照組比較，AngⅡ組A7R5 細胞中α-SMA 熒光強度明顯降低；與AngⅡ組比較，蓮心堿組α-SMA 熒光強度明顯上升，見圖5。

4 討 論

高血壓可引起多種靶器官與部位損害，血管重構為諸多病變之一。研究表明，人體處于高血壓狀態時，血管中層的VSMCs 發生增殖、遷移、凋亡、由收縮型向合成型轉變的表型轉換、膠原沉積，由功能性改變到結構性改變，從而產生血管重構。AngⅡ引起的VSMCs 表型轉換在引起高血壓血管重構中發揮重要作用。VSMCs 分為收縮型與合成型，收縮型主要功能為分布血流和調節血壓，合成型表現為高度增殖。成年動物血管中膜里的VSMCs表現出正常的收縮表型，增殖率極低。處于高血壓等疾病狀態、胎兒期或血管生成過程中的VSMCs以合成表型存在［7］。合成型的VSMCs 可從中膜遷移至內膜，并在內膜中大量增殖，使血管管壁增厚、管腔變窄、血管順應性下降、外周阻力增高，血壓升高，形成高血壓等疾病［8］。血管重構加劇高血壓的發生，形成惡性循環。因此本研究將A7R5 細胞作為研究對象，通過測定蓮心堿進入細胞的含量及蓮心堿對細胞表型轉換的抑制，從而為蓮心堿的降壓作用及血管保護作用的研究奠定基礎。

圖5 3 組A7R5 細胞α-SMA 蛋白熒光免疫圖（×600）

蓮心總堿作為蓮子心的活性成分，具有降低自發性高血壓大鼠的血壓，通過RhoA/ROCK 通路改善高血壓大鼠腹主動脈收縮力及血管重構的作用［9］。而蓮心堿是蓮心總堿的主要成分之一，自1962 年被我國學者首先從蓮子心中分離得到后受到心血管領域研究工作者的關注［10-11］。對蓮心堿的藥代動力學研究表明，蓮心堿靜脈注射在大鼠體內后可分布在心、腦、腎及脾等主要臟器，但是不能穿過血腦屏障，說明蓮心堿可以進入體內發揮作用［12］。蓮心堿可有效降低腎性高血壓大鼠的血壓，還可治療心律失常，其機理是通過抑制鉀電流和鈣電流，使動作電位時程適度延長，從而提高了心律失常的治療效率，為治療室性心律失常的藥物提供了潛在的藥理學基礎，同時這也可能是蓮心堿降壓的機制［13-14］。此外蓮心堿可以抑制去甲腎上腺素誘導的依賴內鈣釋放的兔子離體動脈環收縮［15］，對組胺誘導的豬冠脈平滑肌細胞依賴內鈣性收縮與氯化鈣誘導的依外鈣性收縮均具有抑制作用［16］，可以有效抑制KCl 誘導的離體腸系膜血管平滑肌（VSM）收縮［17］，這些研究表明蓮心堿可能是異常平滑肌收縮的潛在松弛劑。綜上所述，蓮心堿具有重要臨床研究意義，可降低血壓，起到血管保護的作用。但是目前由于蓮心堿不溶于水的特點及降壓、血管保護作用的機制尚不明確。

UPLC-Q-TOF/MS 因其高分辨率和精確的質量測量，通過多級質譜與參考化合物的比較，可以鑒別出未知成分，目前已成為國際公認的藥物成分及藥代動力學分析工具之一。本研究通過UPLCQ-TOF/MS 法測定蓮心堿進入A7R5 細胞的含量，結果顯示蓮心堿在15 min 時進入細胞的效率為15.56%，說明蓮心堿水溶液可以經過細胞膜進入細胞從而發揮作用；并且通過激光共聚焦顯微鏡的觀察，確定了蓮心堿能夠抑制AngⅡ引起的A7R5 細胞由收縮型向合成型轉化，從而證明蓮心堿對血管平滑肌細胞的保護作用，為后續研究蓮心堿防治高血壓，同時保護高血壓血管功能機制研究奠定實驗基礎。