構建電化學適配體生物傳感檢測薏苡仁和白扁豆中赭曲霉毒素A的研究

毛偉偉，胡奕津，黃麗珊，范 申，張紅艷

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122）

近年來，真菌毒素對中藥的污染屢見報道，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）因分布廣泛備受關注［1-2］。人們服用受毒素污染的中藥材或飲片攝入OTA，導致其在體內蓄積，引發肝腎毒性、致癌性和致畸性等嚴重毒性作用［3］。常規的中藥炮制加工并不能完全去除OTA，而受OTA 污染的中藥材脫毒過程繁瑣且昂貴，可能造成活性成分喪失。因此，盡早檢出中藥材或飲片中可能存在的OTA污染，能夠及時對受污染的中藥進行處置，是保障中藥質量和用藥安全的一種經濟有效的方法。

以核酸適配體（aptamer，Apt）為識別元件的電化學生物傳感器結合了適配體高特異性、高親和力與電化學方法簡單便攜、響應快、成本低、靈敏度高等優點，在高靈敏檢測OTA 方面具有廣闊的應用前景［4］。材料科學的發展為高靈敏傳感策略的構建提供了更多選擇。納米金（NG）具有優良的生物相容性和導電性能，被廣泛用作電極修飾材料來提高電化學傳感性能［5］。還原氧化石墨烯（rGO）是一種創新的碳基材料，具有比表面積大、生物相容性好、穩定性好、電催化活性高和導電性好等優點［6］。與化學還原制備的rGO 相比，電化學還原氧化石墨烯（ErGO）具有均勻穩定、經濟環保、簡單快速和易于控制等優點［7］。研究表明，單鏈DNA（ssDNA）的堿基能夠與rGO 表面豐富的芳香環結構產生π-π堆疊作用而被吸附到rGO 表面［8］。該特性被廣泛用于構建熒光和電化學適配體傳感方法，對目標物進行快速定量檢測［9-10］。

基于上述研究基礎，本研究通過一步電沉積法制備ErGO-NG 涂層修飾的玻碳電極，吸附亞甲基藍（MB）標記的OTA 特異性單鏈核酸適配體，構建高靈敏、快速檢測OTA 的新方法，并將其應用于中藥樣品中OTA 的檢測，以期為中藥材OTA 污染現場快速檢測提供新思路。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 CHI660E 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；CHB-202恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司）；BSA224S 電子分析天平（德國Sartorius公司）；5810R 臺式離心機、minispin plus 高速離心機（德國Eppendorf 公司）；ALPHA 1-2LD PLUS 凍干機（德國Marin Christ 公司）；SHP-250 生化培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ-116 超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FE28 型pH 計（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q Integra 超純水機（法國Merckmillipore 公司）。

1.2 實驗試劑與藥物 氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；石墨粉（上海麥克林生化科技有限公司）；四氯金酸三水合物（上海阿拉丁生化科技有限公司）；玻碳電極（武漢高仕睿聯科技有限公司）；銀/氯化銀參比電極和鉑絲對電極（上海辰華儀器有限公司）；OTA、黃曲霉毒素B1（AFB1）、嘔吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）標準品（純度＞99%）（北京壇墨質檢科技有限公司）；本實驗中所有試劑均為分析純級別；所有水溶液均使用Millipore Milli-Q 系統純化的超純水（18.2 MΩ·cm）配制；中藥飲片薏苡仁和白扁豆均購自福州本地藥店；本實驗所用3'端標記有MB 的OTA 適配體（Apt-MB）序列為：5'-GATCGGGTCTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-MB-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。

2 實驗方法

2.1 氧化石墨烯（GO）的合成與表征 將0.5 g 石墨粉、0.5 g 硝酸鈉和23 mL 的濃硫酸置于圓底燒瓶中，于冰水浴中攪拌混勻，加入3 g KMnO4粉末，于35 ℃下持續攪拌約1 h，直到圓底燒瓶中形成濃稠的糊狀物。接著加入40 mL 超純水，同時迅速將溫度提高至90 ℃，繼續攪拌30 min。最后加入100 mL超純水與3 mL 的30%過氧化氫溶液，當混合液的顏色由深棕色變為黃色表示反應終止。將混合液趁熱過濾，將濾餅攪拌分散在超純水中，隨后將濾餅分散液分裝在50 mL 的離心管中，1 000 r/min 低轉速離心3 min，多次重復操作直至完全去除大顆粒沉淀物。取上清液在8 000 r/min 下離心15 min，取沉淀物GO 重懸到超純水中，并用超聲處理以促進GO 的分散。將上述制備的GO 分散液進行冷凍干燥，最終得到干燥蓬松的黃色GO 粉末。將合成的GO 分散在水中，采用透射電子顯微鏡對其形貌進行表征。

2.2 工作電極的制備 將玻碳電極（GCE）打磨拋光至光滑鏡面并對GCE 進行活化，將活化后的GCE、銀/氯化銀參比電極和鉑絲對電極構成的三電極體系浸入含有0.5 mg/mL GO 和2.5 mmol/L 氯金酸的混合溶液中，采用循環伏安法（CV）在+0.6～-1.6 V 電位范圍內電沉積5 圈制備ErGO 和NG涂層修飾的GCE（ErGO-NG/GCE），用超純水清洗后干燥備用。

2.3 傳感器的構建及OTA 的電化學檢測 將“2.2”項下制備的ErGO-NG/GCE 浸泡在含1 μmol/L Apt-MB 的PBS 緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）中孵育2 h，孵育后PBS 緩沖液清洗，低流速氮氣干燥即完成傳感器的構建。將20 μL 不同濃度的OTA 標準品溶液滴加在電極表面，于20 ℃下反應1 h，用PBS 緩沖液沖洗后將電極體系置于PBS 緩沖液中進行差分脈沖伏安法（DPV）檢測。

2.4 方法的條件優化 為使所建立的傳感方法具有最佳表現，在OTA 濃度為10 ng/mL 條件下，以達到最大峰電流差值ΔIp（ΔIp＝I－I0，其中I 和I0分別表示待測物加入后與前的峰電流值）為判斷依據，依次對Apt-MB 的濃度（0.5、0.8、1、1.5、2 μmol/L）、OTA 與Apt-MB 的反應溫度（10～35 ℃）、反應緩沖液的pH（6.0～8.5）和反應時間（15～120 min）分別進行了優化。

2.5 方法的選擇性考察 在最優的實驗條件下，將構建好的傳感器分別與空白PBS 緩沖液、5 ng/mL OTA 標準品溶液、50 ng/mL 的其他真菌毒素（AFB1、ZEN 和DON）標準品溶液以及上述毒素混合物溶液（含5 ng/mL OTA 和50 ng/mL 的其他真菌毒素）孵育并用PBS 緩沖液沖洗后，將電極體系置于PBS 緩沖液中進行DPV 檢測，每組平行測定3 次。

2.6 方法的重復性與再現性考察 在最優的實驗條件下，使用同一批次的GCE 按照“2.2”“2.3”項構建傳感器，與5 ng/mL 的OTA 孵育后采用DPV 平行測定6 次，并記錄峰電流變化考察方法的重復性；使用不同批次的GCE 同樣按照“2.2”“2.3”項構建傳感器，與5 ng/mL 的OTA 孵育后采用DPV 平行測定6次，并記錄峰電流變化考察方法的再現性。

2.7 中藥樣品加標回收率測定 分別將中藥飲片薏苡仁和白扁豆打粉過篩，稱取1.0 g 藥材細粉于50 mL 離心管中，加入適量OTA 標準溶液，混勻后加入10 mL 甲醇-水（7∶3）超聲提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜后取續濾液，用PBS 緩沖液稀釋定容，制成低、中、高（0.1、1.0、10.0 ng/mL）3 種濃度的OTA 樣品溶液進行加標回收率測定，每種濃度平行測定3 次。

3 結 果

3.1 GO 與ErGO-NG/GCE 的形貌表征 從圖1A的透射電鏡圖可以看出本實驗所合成的GO 在溶液中能夠被剝離分散成單片薄層，并呈現出卷曲、褶皺和邊緣折疊的GO 典型形貌特征，證明了GO 的成功制備；從圖1B 的掃描電鏡圖可以觀察到GCE電極表面電沉積的ErGO 具有更多的褶皺結構，并且NG 能夠分散在ErGO 涂層中，表明一步電沉積法成功制備了ErGO-NG/GCE。

圖1 GO 與ErGO-NG/GCE 的形貌表征圖

3.2 傳感平臺構建的電化學表征 在-0.2～+0.6 V電位范圍內，采用CV 法以50 mV/s 的掃描速率在含0.1 mol/L KCl 和5.0 mmol/L［Fe（CN）6］4-/3-的PBS緩沖液中對不同修飾階段的電極進行表征。如圖2 所示，裸GCE 具有一對大小相近的氧化還原峰（曲線a），當在GCE 表面電沉積ErGO-NG 后，可以看到氧化還原峰電流均增大（曲線b），這是由于導電性良好的ErGO 和NG 改善了電極表面的電導率；當Apt-MB 修飾到ErGO-NG/GCE 表面后，觀察到曲線c 的氧化還原峰電流大幅下降，并且峰間電位差增大，這是由于Apt-MB 的磷酸骨架帶負電荷，對同樣帶負電的電子具有排斥作用，此外大量Apt-MB 的吸附也增大了電極表面的空間位阻，最終導致電極表面電導率下降。上述結果表明各組分在GCE 表面的組裝是成功的，間接證明了所構建的傳感平臺的可行性。

圖2 不同修飾電極的CV 圖

3.3 Apt-MB 濃度的優化 從圖3 可以看出，ΔIp隨著Apt-MB 的濃度增大而增大，當Apt-MB 濃度為1 μmol/L 時產生的ΔIp達到平臺值，即使繼續增大Apt-MB 濃度也沒有明顯增大，因此選擇1 μmol/L的Apt-MB 進行后續實驗。

圖3 不同濃度Apt-MB 對峰電流差值的影響

3.4 OTA 反應條件的優化 從圖4A 可以看出，隨著反應溫度的增大，ΔIp呈現先增大后減小的趨勢，因此選擇20 ℃作為最優反應溫度；從圖4B 可以看出，當反應緩沖液的pH 值為7.4 時，ΔIp達到最大值，因此選擇pH 7.4 的緩沖液進行后續實驗；從圖4C 可以看出，ΔIp隨著反應時間的增加而增大，并在反應60 min 時達到平臺值，因此選擇60 min 作為后續OTA 與Apt-MB 的反應時間。

圖4 OTA 與Apt-MB 的不同反應條件對峰電流差值的影響

3.5 標準曲線的建立 在最優的實驗條件下對不同濃度的OTA 進行DPV 檢測，結果如圖5A 所示。在0～10 ng/mL 范圍內，隨著OTA 濃度的增加，吸附在電極表面的Apt-MB 不斷與OTA 結合并脫離電極表面，導致MB 信號電流不斷減小。研究發現，在0.05～10 ng/mL 范圍內，峰電流值Ip與OTA 濃度的對數（logCOTA）之間具有良好的線性關系，如圖5B所示，線性方程為：Ip＝1.446 9logCOTA－11.338 1，相關系數r＝0.993 8，檢測限（3 σ/S）為0.03 ng/mL。

3.6 方法的選擇性考察 在最優條件下，用本方法分別 對5 ng/mL 的OTA 和50 ng/mL 的AFB1、ZEN和DON 進行檢測。從圖6 可以看出，盡管非目標毒素的濃度為OTA 的10 倍，但它們產生的ΔIp值都很小，而5 ng/mL 的OTA 則能夠產生明顯增大的ΔIp值。此外，毒素混合物溶液也會使ΔIp值明顯增大，并且產生的ΔIp值與單獨OTA 的ΔIp值基本一致，上述結果表明本方法對OTA 具有較強的選擇性，即本傳感器能夠有效對抗其他毒素成分對OTA 檢測的干擾。

圖5 OTA 標準曲線的建立

圖6 方法的選擇性考察

3.7 方法的重復性和再現性考察 在最優條件下，分別使用同批次和不同批次的GCE 電極構建傳感器對5 ng/mL 的OTA 平行測定6 次，并記錄峰電流變化。實驗結果表明，6 次重復性測定和再現性測定結果的相對標準偏差（RSD）分別為2.11%和3.64%，表明本方法具有良好的重復性和再現性。

3.8 中藥實際樣品加標回收率測定 選擇2020 年版《中華人民共和國藥典》中規定OTA 檢測的中藥薏苡仁和白扁豆進行加標回收測試。在經HPLC及本方法皆未檢出OTA 的薏苡仁和白扁豆樣品中分別添加0.1、1、10 ng/mL 的OTA 標準品，加標樣品采用本方法進行測定，結果如表1所示，本方法對2種中藥飲片樣品的加標回收率為92.94%～105.17%，RSD≤5.60%，說明該方法回收率和穩定性良好，具有快速檢測中藥材OTA 污染的應用前景。

4 討 論

目前常用的OTA 檢測方法包括基于色譜的檢測法（如高效液相色譜及其與質譜的聯用法等）和免疫分析法（如酶聯免疫測定法和膠體金免疫層析法等）。前者靈敏度高、結果精確，但需要大型且昂貴的儀器與專業的檢測人員，無法滿足中藥材OTA現場快速檢測的需求；后者快速高效、特異性強，但抗體存在制備過程復雜、穩定性差、具有批次間差異等缺陷，限制了其廣泛應用［11］。

表1 薏苡仁與白扁豆樣品中OTA 的加標回收率測定（n＝3）

本研究基于ErGO-NG 材料和OTA 特異性適配體構建了一種電化學傳感檢測方法用于OTA 的高靈敏檢測，見圖7。Apt-MB 通過π-π 堆疊作用吸附在ErGO-NG/GCE 表面，當體系中不存在OTA時，電極表面吸附的MB 分子在一定電位下可產生較大的峰電流；當體系中存在OTA 時，OTA 可與Apt-MB 結合形成穩定復合物，使Apt-MB 的結構發生卷曲，削弱了適配體與電極表面的π-π 堆疊作用，導致部分Apt-MB 遠離電極表面，使吸附在電極表面的MB 減少，相應的峰電流發生改變。據此可通過測量峰電流的變化實現對OTA 的定量檢測。

圖7 OTA 電化學傳感檢測的原理圖

在最優條件下，本方法的線性范圍為0.05～10 ng/mL，檢測限為0.03 ng/mL。這應該歸功于通過一步電沉積法修飾在電極表面的ErGO-NG 材料具有良好的生物相容性和導電性能，提高了電極的導電能力，進而大大提高了方法的靈敏度。將本方法應用于中藥實際樣品薏苡仁和白扁豆中OTA 的測定，加標回收率為92.94%～105.17%，RSD≤5.60%。該方法具有制作簡單、操作方便、響應速度快、檢測效率高、成本低廉和靈敏度高等優點。此外，本方法的選擇性強，即使在其他高濃度真菌毒素共存的情況下，也能實現對OTA 檢測，具有中藥材OTA 污染現場快速檢測的應用前景。

本方法具有潛在的通用性，可將識別元件更換為其他真菌毒素的適配體，可能實現對其他真菌毒素的快速檢測，有望為中藥材中真菌毒素的現場快速檢測提供一種經濟便利、高效靈敏的新思路。