基于整合藥理學的安子調(diào)沖方改善復發(fā)性流產(chǎn)合并抗磷脂綜合征的分子機制研究

何 珊，寧 艷，馬 飛，蔣紹艷，劉大艷，王智瑋，吳芳婷

（南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院，廣東深圳 518028）

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶，在妊娠前20 周，連續(xù)發(fā)生3 次及以上自然流產(chǎn)，其發(fā)生率約占育齡期女性的1%～5%［1］。生殖免疫、內(nèi)分泌、感染、遺傳、解剖及環(huán)境等被認為是RSA 的誘發(fā)因素。然而，RSA 的臨床診治具有一定的難度，因其有病因復雜、特異性臨床表現(xiàn)和診斷標準缺乏等的特點，且治療手段尚存爭議［2］。近年來，一種自身免疫疾病，由抗磷脂抗體與自身磷脂抗原相互作用引發(fā)的抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）所致RSA 在臨床中的發(fā)病率逐年提升［3］，可出現(xiàn)動靜脈血栓形成、動脈粥樣硬化、胎停等一系列癥狀［4-5］。APS 約占RSA 病因的20%。患者多因RSA 就醫(yī)時首次發(fā)現(xiàn)APS。目前認為APS 導致RSA 的過程是血管內(nèi)皮和胎盤滋養(yǎng)層細胞表面的磷脂與抗磷脂抗體結(jié)合，促進炎癥因子釋放，破壞內(nèi)皮細胞，影響胚胎滋養(yǎng)層細胞的遷徙和浸潤，同時來源于血小板的表面受體與抗原抗體復合物結(jié)合后導致血小板聚集黏附增多，促進發(fā)生磷脂依賴的凝血［6］，共同引起胎盤內(nèi)的動靜脈血栓，干擾胎盤功能，最終發(fā)生妊娠不良事件［7］。

RSA/APS 常用低分子肝素、阿司匹林治療，雖具有一定療效，但不良反應較多，導致患者精神心理負擔加重甚至拒絕使用西藥，從而傾向于毒性低、較少不良反應、安全穩(wěn)定的中藥保胎療法。安子調(diào)沖方（ATF）為深圳市婦幼保健院近10 年在臨床治療復發(fā)性流產(chǎn)中取得較好療效的經(jīng)驗方，由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、蒲黃炭、雞血藤、人參和陳皮組成。方中以補腎活血為法，以壽胎丸去阿膠加健脾行氣活血之品而成。本研究借助中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0（TCMIP V2.0），從分子水平建立ATF 治療RSA/APS 的多成分、多靶點及多通路作用網(wǎng)絡，詮釋ATF 治療RSA/APS 的可能作用機制，以期為該復方的臨床應用提供依據(jù)。

1 方 法

1.1 ATF 化學成分來源 基于TCMIP V2.0（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）［8］的“中藥材數(shù)據(jù)庫”，收集菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、蒲黃炭、雞血藤、人參、陳皮所含化學成分（TCMIP V2.0 的“中藥材數(shù)據(jù)庫”沒有收錄蒲黃炭的化學成分和相關(guān)靶標信息，本文使用的是蒲黃的相關(guān)數(shù)據(jù)），構(gòu)建ATF化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 RSA/APS 靶標收集 在TCMIP V2.0“疾病相關(guān)分子庫”中輸入關(guān)鍵詞“antiphospholipid syndrome”及“recurrent spontaneous abortion”，并通過GeneCards（http：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）完善相關(guān)的疾病靶標，去重后建立RSA/APS靶標數(shù)據(jù)庫。

1.3 ATF 治療RSA/APS 的潛在靶標 利用Venny 2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分析活性成分和RSA/APS 靶點，得到ATF 治療RSA/APS 的潛在靶標。

1.4 潛在靶標相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建 為了闡明潛在靶標在系統(tǒng)水平上的相互作用關(guān)系，將“1.3”項得到的靶標上傳到STRING 11.0（https：//string-db.org/）［9］，設(shè)置“homo sapines”的Organism，minimum required interaction score 的confidence 為0.4，把孤立靶蛋白清除，收集蛋白互作信息，并導入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡并進行拓撲學分析，對度值（degree，D），介數(shù)（betweenness，B）、接近中心性（closeness，C）和特征向量中心性（eigenvector，E）進行分析，分析大于D 值中位數(shù)的靶標，進一步計算B、C和E，核心靶標需同時滿足D、B、C 和E 拓撲結(jié)構(gòu)特征值均大于中位數(shù)。

1.5 ATF 治療RSA/APS 潛在靶標的通路和功能分析及網(wǎng)絡構(gòu)建 潛在靶標利用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，構(gòu)建ATF 治療RSA/APS 的多維網(wǎng)絡。

1.6 吸收水平分析 在“1.5”項下構(gòu)建的多維網(wǎng)絡中，來源于多種中藥的成分為核心成分，檢索TCMIP V2.0 的“中藥成分數(shù)據(jù)庫”，獲取吸收、分配、代謝、排泄和毒性（ADMET）吸收水平（ADMET Absorption Level），數(shù)值含義依次為：“Good”用0 表示，“Moderate”用1 表示，“Low”用2 表示，“Very low”用3 表示。結(jié)合ADMET 中的重要藥動學參數(shù)口服生物利用度（OB）以及類藥性（DL）對核心化學成分進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 ATF 化學成分及其靶標預測 共獲得ATF 中化學成分256 個，預測靶標847 個。菟絲子8 種成分，81 個靶標；桑寄生6 種成分，139 個靶標；續(xù)斷1種成分，21個靶標；蒲黃24種成分，242個靶標；雞血藤20 種成分，54 個靶標；人 參157 種成分，823 個靶標；陳皮48 種成分，80 個靶標。其中有8 種成分重復。

2.2 ATF 治療RSA/APS 的潛在靶標及其相互作用 共得到500 個RSA/APS 的靶標。將ATF 靶標與RSA/APS 靶標進行匹配，得到45 個ATF 治療RSA/APS 的潛在靶標。將潛在靶標在STRING 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡，見圖1，并把網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.7.2 軟件進行網(wǎng)絡拓撲學分析，滿足“1.4”項下篩選條件的16 個靶標為可能的核心靶標，分別是白介素-6（IL-6，D＝29）、腫瘤壞死因子（TNF，D＝23）、SRC 原癌基因/非受體酪氨酸激酶（SRC，D＝21）、雌激素受體α（ESR1，D＝20）、環(huán)加氧酶2（PTGS2，D＝18）、白介素-1β（IL-1B，D＝17）、Toll 樣受體4（TLR4，D＝17）、細胞色素P450家族19A1（CYP19A1，D＝15）。

圖1 ATF 治療RSA/APS 潛在靶標相互作用網(wǎng)絡圖

2.3 ATF 治療RSA/APS 潛在靶標的通路和功能分析 潛在靶標主要富集于核因子-κB 進入細胞核的正調(diào)節(jié)（positive regulation of NF-κB import into nucleus）、炎癥應答（inflammatory response）、生成白介素-6 的正調(diào)節(jié)（positive regulation of interleukin-6 production）和趨化因子產(chǎn)生的正調(diào)控（positive regulation of chemokine production）等與RSA/APS 發(fā)生相關(guān)的功能；主要富集于KEGG 的關(guān)鍵通路有核因子-κB 信號通路（NF-κB signaling pathway）和Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等，見圖2、圖3。

2.4 ATF 治療RSA/APS 的多維網(wǎng)絡 應用“2.3”項中的關(guān)鍵GO 功能及KEGG 通路構(gòu)建“中藥復方-成分-潛在靶標-關(guān)鍵功能及通路”的多維網(wǎng)絡，見圖4。結(jié)果涉及ATF 的98 種成分及23 個靶標。菟絲子5 種，續(xù)斷1 種，桑寄生6 種，蒲黃15 種，雞血藤1 種，人參74 種，陳皮1 種。其中槲皮素為菟絲子、桑寄生和蒲黃共有成分，山奈酚為菟絲子和人參的共有成分，棕櫚酸來自人參和蒲黃，β-谷甾醇為蒲黃、人參和陳皮的共有成分。這些成分通過聯(lián)合調(diào)節(jié)TNF、IL-6、IL-1B 等靶標參與氧化還原過程、炎癥應答等功能及Toll樣受體和核因子κB等信號通路。

2.5 ATF 核心成分的吸收水平分析 在“2.4”項下所構(gòu)建的多維網(wǎng)絡中來源于多種中藥組分的4 種成分為核心成分，并進行ADMET 吸收水平分析，見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素和山奈酚吸收水平較好。

圖2 ATF 治療RSA/APS 潛在靶標GO 功能

圖3 ATF 治療RSA/APS 潛在靶標KEGG 通路富集分析

圖4 ATF 治療RSA/APS 的多維網(wǎng)絡

3 討 論

RSA/APS 由于內(nèi)皮細胞被抗磷脂抗體破壞，再加上抗原抗體復合物引起的血小板黏附增多，導致血栓在微循環(huán)內(nèi)形成。同時滋養(yǎng)細胞也可被抗磷脂抗體破壞，繼而導致妊娠不良事件的發(fā)生。本研究團隊為嶺南羅氏婦科工作分站點，團隊骨干成員師承羅頌平教授，經(jīng)過多年對名醫(yī)學術(shù)思想和臨證經(jīng)驗的繼承、整理和發(fā)揚，發(fā)現(xiàn)RSA/APS 的病機為腎虛、胎元不固，合并血瘀證［10］。所以臨床以補腎活血為治則，以壽胎丸為基礎(chǔ)方，去阿膠加行氣活血之品而成的安子調(diào)沖方，方中君藥菟絲子，補腎安子，益精固沖；臣藥續(xù)斷和桑寄生，共起補肝腎、調(diào)沖任的作用，使胎氣強壯；佐以蒲黃炭、雞血藤以活血化瘀，人參、陳皮為使，健脾、補氣、行氣以助活血之效，七藥共奏補腎安胎、活血調(diào)沖之功。此方已在我院臨床使用近10年，并有較好改善RSA/APS 的臨床療效，但是其作用機制并未闡明。本文應用大數(shù)據(jù)的手段，通過整合藥理學的策略［11］，充分利用國內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)平臺及相關(guān)分析軟件，搜集ATF 治療RSA/APS 的潛在作用靶標，并對其進行分析，構(gòu)建了“中藥復方-成分-潛在靶標-關(guān)鍵功能及通路”網(wǎng)絡。

通過檢索TCMIP V2.0、OMIM 和GeneCard 得到500 個RSA/APS 靶標，與ATF 的847 個靶標進行匹配，獲得45 個ATF 治療RSA/APS 的潛在靶標。這些潛在靶標主要作用于NF-κB 進入細胞核的正調(diào)節(jié)、炎癥應答、生成IL-6 的正調(diào)節(jié)及趨化因子產(chǎn)生的正調(diào)控等功能。主要富集于核因子κB 信號通路和Toll 樣受體信號通路等KEGG 關(guān)鍵信號通路。進一步構(gòu)建“中藥復方-成分-潛在靶標-關(guān)鍵功能及通路”的多維網(wǎng)絡。通過分析，ATF 中的槲皮素、山奈酚、棕櫚酸和β-谷甾醇等通過TNF、IL-6、IL-1B 作用于以上關(guān)鍵功能和通路。ZHAO 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路降低糖尿病周圍神經(jīng)病變模型大鼠的炎癥反應。QU 等［13］研究證明，山奈酚可通過抑制LPSTLR4-NF-κB 軸減輕小鼠實驗性結(jié)腸炎。TLR4/NF-κB 信號通路的炎性因子TNF-α、NF-κB 在RSA/APS 患者蛻膜、血清中的表達較正常孕婦顯著升高，其可能參與了炎性、血栓生成的進程，與流產(chǎn)發(fā)生密切相關(guān)［14］。RSA/APS 大鼠血清及胎盤的IL-6 水平處于異常水平［15］。推測ATF 可能經(jīng)TNFα、IL-6 等炎性因子調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 通路發(fā)揮治療RSA/APS 的作用。

本研究團隊在前期已對安子調(diào)沖湯的基礎(chǔ)方，即減味壽胎丸治療自然流產(chǎn)進行了網(wǎng)絡藥理學研究［16］。君藥菟絲子的活性成分槲皮素，也是ATF的核心成分之一，為黃酮類化合物，有較好的ADMET 吸收水平。槲皮素可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 蛋白的表達而抑制子宮內(nèi)膜細胞凋亡，從而有利于胚胎著床［17］。槲皮素可抑制RSA 小鼠外周血Th1、Th2的數(shù)量以及IL-6、IL-8 的分泌，從而調(diào)節(jié)被破壞的免疫平衡［18］。槲皮素可以通過調(diào)節(jié)巨噬細胞數(shù)量和IL-10 的分泌改善脂多糖（LPS）誘導的RSA 小鼠的LPS所致的損傷作用［19］。槲皮素可抑制p38MAPK和JNK 磷酸化激活下游凋亡信號通路，起到保護滋養(yǎng)細胞的作用，同時有利于滋養(yǎng)細胞植入子宮內(nèi)膜［20］。推測槲皮素在ATF 治療RSA/APS 中也發(fā)揮重要作用。

本文通過整合藥理學技術(shù)分析了安子調(diào)沖方治療RSA/APS 的潛在作用靶標，并富集分析了靶標參與的生物過程，此外，構(gòu)建了“中藥復方-成分-潛在靶標-關(guān)鍵功能及通路”網(wǎng)絡，闡釋了ATF 治療RSA/APS 的可能分子機制，為該方治療RSA/APS 提供了臨床依據(jù)，也為其體內(nèi)外實驗研究提供參考。