QuEChERS-UPLC-MS/MS 法測定獼猴桃中12 種農(nóng)藥殘留的研究

程 瀧， 黃 露，馮 吉，吳 玉，邱棟樑

（1.德陽市食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，四川德陽 618000；2.德陽市食品檢驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川德陽 618000）

0 引言

獼猴桃是獼猴桃科獼猴桃屬植物，其果肉質(zhì)地柔軟、口感酸甜，深受消費(fèi)者喜愛，中國是獼猴桃的原產(chǎn)地，在種植過程中，也會(huì)存在一些病蟲害，造成獼猴桃產(chǎn)量的損失，主要病害有潰瘍病、炭疽病、膏藥病、軟腐病、灰霉病、根腐病、褐斑病及生理性缺素癥等，蟲害有小薪甲、葉蟬、斜紋夜蛾、紅蜘蛛、介殼蟲、根結(jié)線蟲、蝽類等。同其他水果一樣，獼猴桃在生長過程中使用化學(xué)農(nóng)藥是防治病蟲害的重要手段和措施，殺蟲劑、殺菌劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、保鮮劑等的使用比較普遍[1-3]。近年來，我國獼猴桃種植面積擴(kuò)大，各主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)病蟲害發(fā)生的頻次有所增加，以至于農(nóng)藥使用增多。為了防止生產(chǎn)上存在濫用、超劑量使用造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)的情況，給獼猴桃質(zhì)量安全帶來一定的隱患，影響消費(fèi)者健康，因此有必要對(duì)目前市場流通環(huán)節(jié)中獼猴桃產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留狀況進(jìn)行監(jiān)控。

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法為GB/T 20769—2008[4]水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留量分析的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。但該方法前處理操作繁瑣、消耗大量，對(duì)環(huán)境有污染的試劑如乙腈、甲苯這樣的有機(jī)溶劑，不適合大批樣品的快速定性及定量分析。ANASTASSI-ADES 等于2003 年首次提出QuEChERS 前處理方法，與固相萃取柱凈化法相比，具有前處理高效快捷、溶劑用量少、樣品制備簡便、回收率良好，可同時(shí)處理大批量樣品等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留分析中得到廣泛的應(yīng)用[5-12]。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer，UPLC-MS/MS）對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜、干擾嚴(yán)重的痕量化合物能夠在短時(shí)間進(jìn)行定性定量分析。使用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，以獼猴桃作為研究對(duì)象，對(duì)QuEChERS 前處理凈化劑的選擇、色譜條件、樣品復(fù)溶溶劑等做了優(yōu)化研究，以構(gòu)建一種能有效去除色素、糖類等雜質(zhì)干擾因素，能用于獼猴桃中農(nóng)藥殘留快速檢測并節(jié)約成本的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀。Agilent 1290 型超高效液相色譜儀，美國安捷倫公司產(chǎn)品；QTRAP 4500 三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜，配有電噴霧離子源（ESI）、MultiQuantTM 定量軟件，美國AB SCIEX 公司產(chǎn)品；MS205DU 型電子天平，瑞士Mettler-Toledo 公司產(chǎn)品；MTN-5800A 型氮吹濃縮裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；VG3 S025 型渦旋振蕩器，德國IKA 公司產(chǎn)品；HLS-1053 型組織破碎機(jī)，深圳海力士公司產(chǎn)品；TGL-16A 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

（2）12 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液。吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、烯酰嗎啉、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、辛硫磷、霜霉威、敵百蟲、殺蟲脒、唑蟲酰胺、噻蟲嗪、噻蟲胺（1 000 μg/mL）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，45 μm），北京振翔科技有限公司提供；乙腈、甲醇（色譜純），德國Merck 公司提供；甲酸（優(yōu)級(jí)純），成都科隆化學(xué)品有限公司提供；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純），成都科龍化工試劑廠提供；石墨化炭黑（GCB，45 μm），北京振翔提供；尼龍微孔濾膜，天津津騰公司實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別精密量取不同質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋得混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（質(zhì)量濃度為吡蟲啉400 ng/mL，啶蟲脒400 ng/mL，多菌靈400 ng/mL，烯酰嗎啉200 ng/mL，甲氨基阿維菌素174.8 ng/mL，辛硫磷20 000 ng/mL，霜霉威50 ng/mL，敵百蟲200 ng/mL，唑蟲酰胺50 ng/mL，殺蟲脒1 000 ng/mL，噻蟲嗪5 000 ng/mL，噻蟲胺 10 000 ng/mL）。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0.01，0.02，0.04，0.10，0.20 mL 用空白樣品提取液定容至2.00 mL 制得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 樣品處理

獼猴桃去柄取全果，打碎混勻。稱取10 g 試樣于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈和2 g 氯化鈉，渦旋振蕩器上混合3 min 后置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速7 000 r/min 離心5 min 分層。

取5 mL 上層有機(jī)相加入到內(nèi)含150 mg PSA、30 mg 石墨化炭黑（GCB）和600 mg 無水硫酸鎂的50 mL 離心管中。渦旋振蕩器上混合1 min 后置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速7 000 r/min 離心2 min，將全部上清液過0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜到10 mL 試管中40 ℃水浴氮吹至干。用1.00 mL 的0.1%甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）復(fù)溶后渦旋振蕩器上混勻，過0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中待測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18RRHD（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃。

梯度洗脫條件見表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM），電噴霧電壓（IS）：5 500 V，碰撞氣（CAD）：Medium，離子源溫度（TEM）500 ℃。

12 種農(nóng)藥的特征離子參考質(zhì)譜條件見表2。

表2 12 種農(nóng)藥的特征離子參考質(zhì)譜條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和Origin 8.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的優(yōu)化

為了除去樣品中的色素及其他雜質(zhì)，降低基質(zhì)干擾，減少樣品在進(jìn)樣過程中對(duì)色譜柱和離子源的污染，對(duì)QuEChERS 法常使用的3 種凈化劑：PSA、Z-Sep+、石墨化炭黑（GCB）進(jìn)行篩選。PSA 由硅膠鍵合乙二胺基-N-丙基得到一種固相吸附劑，具有2 個(gè)氨基，有去除糖、有機(jī)酸、脂肪酸、花青素色素、金屬離子等的能力。Z-Sep+是一種在硅膠基質(zhì)表面雙重鍵合了C18和Z-Sep+（二氧化鋯涂層的二氧化硅）的新型填料，對(duì)甘油酯和磷脂具有很強(qiáng)的吸附力，可以用于凈化脂肪含量大于15%的樣品。石墨化炭黑（GCB）可以有效去除色素和固醇類雜質(zhì)。分別稱取PSA、Z-Sep+、GCB 3 種凈化劑各30，100，150，300，500 mg，加入5 mL 空白樣品提取液和600 mg 無水硫酸鎂，再加入12 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)使用液，考查這3 種凈化劑各自作用效果，通過回收率考查及觀察樣本顏色變化考查凈化劑對(duì)目標(biāo)物的吸附情況及去除色素雜質(zhì)的效果。150 mg PSA 農(nóng)藥回收率在60%～81%，300 mg 以上總體回收率開始下降，并且無明顯除色素作用。對(duì)于GBC 加入100 mg的樣品雖然色素能夠部分去除，但是多菌靈回收率只有42%，原因可能是其六元環(huán)結(jié)構(gòu)會(huì)吸附對(duì)稱結(jié)構(gòu)及平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，導(dǎo)致回收率降低[13-14]。而加入100 mg 的Z-Sep+的樣品中多菌靈、殺蟲脒、敵百蟲有明顯吸附，回收率分別只有38%，46%，50%。可能是農(nóng)藥有羥基（-OH）、氨基（-NH2）等官能團(tuán)，可與Z-Sep+含有的氧化鋯（ZrO2）發(fā)生路易斯酸-堿作用，從而導(dǎo)致農(nóng)藥損失[15]。考慮到獼猴桃樣本脂肪類含量少但有大量色素及糖類等雜質(zhì)的存在，最終使用內(nèi)含600 mg 無水硫酸鎂、150 mg PSA 及30 mg GCB 的QuEChERS 凈化劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為了得到較好分離度的農(nóng)藥色譜峰、避免雜質(zhì)與檢測農(nóng)藥共同進(jìn)入離子源造成基質(zhì)效應(yīng)干擾影響試驗(yàn)，所以對(duì)流動(dòng)相及比例優(yōu)化。因?yàn)闄z測的12 種農(nóng)藥均為正離子模式，為了提高離子化效率以0.1%的甲酸水溶液為水相。再篩選甲醇和乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相。當(dāng)用甲醇作為流動(dòng)相可以使各農(nóng)藥色譜峰有很好的分離度，但是柱壓較高，不利于色譜柱和設(shè)備的運(yùn)行，如果降低流速可減小柱壓但又增加了檢測時(shí)間，不利于快速檢測，以乙腈為流動(dòng)相大部分出峰時(shí)間較快，柱壓較低，0.5 mL/min 流速柱壓也只有400 bar，這樣減少檢測時(shí)間，調(diào)整水相與乙腈比例后農(nóng)藥色譜峰也能得到較好分離度。

12 種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖1，12 種農(nóng)藥化合物定量離子色譜圖見圖2。

圖1 12 種農(nóng)藥的總離子流色譜圖

圖2 12 種農(nóng)藥化合物定量離子色譜圖

2.3 復(fù)溶溶劑的考察

超高效液相色譜儀在使用1.8 μm 的C18色譜柱進(jìn)樣過程中通常都用較小的流速進(jìn)行試驗(yàn)，這樣溶劑效應(yīng)的影響尤為明顯。為了獲得較好的色譜峰形并且減少溶劑效應(yīng)，樣品前處理時(shí)所使用的樣品復(fù)溶溶劑多為初始流動(dòng)相，而在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)如果用0.1%的甲酸水溶液∶乙腈（9∶1）復(fù)溶過濾后，檢測辛硫磷、甲氨基阿維菌素、唑蟲酰胺極性小的農(nóng)藥回收率小于20%，樣品溶液過濾膜后顏色很淺，可能原因是色素等雜質(zhì)在被濾膜截留的同時(shí)對(duì)極性較小農(nóng)藥有部分吸附導(dǎo)致回收率低。而用0.1%的甲酸水溶液∶乙腈（1∶1）復(fù)溶過濾后檢測，雖然辛硫磷、甲氨基阿維菌素、唑蟲酰胺回收率大于60%，但是霜霉威、多菌靈、殺蟲脒、噻蟲嗪這樣極性較大的農(nóng)藥因?yàn)槿軇┬?yīng)出峰呈現(xiàn)“M”型的色譜峰不利于定量，且樣品溶液顏色較深。最終選用0.1%的甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）溶液復(fù)溶過濾，回收率均大于60%，溶液顏色較淺。通過試驗(yàn)得知選擇合適復(fù)溶液過濾后既能再次除部分殘留色素，又能保證峰形完整和檢測的回收率。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)是由待測物質(zhì)被共流出的其他雜質(zhì)組分，影響電噴霧電離過程中的離子化所致，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)或抑制作用。獼猴桃中含有的色素、糖類、維生素等內(nèi)源物質(zhì)，均為農(nóng)藥殘留檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的來源[16-20]。試驗(yàn)通過比對(duì)同濃度基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和定容溶劑0.1%的甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的儀器檢測峰面積比值來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，即基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。基質(zhì)效應(yīng)大于1 為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，反之則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

獼猴桃中12 種農(nóng)藥基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)見表3。

表3 獼猴桃中12 種農(nóng)藥基質(zhì)提取液中的基質(zhì)效應(yīng)

由表3 可知，獼猴桃中12 種農(nóng)藥均呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，且霜霉威、敵百蟲、辛硫磷基質(zhì)抑制較為明顯，所以采用獼猴桃基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液作工作曲線來校正獼猴桃基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 方法的線性關(guān)系、檢出限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

使用獼猴桃陰性樣品提取液，稀釋12 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在優(yōu)化好的UPLC-MS/MS 儀器條件下進(jìn)行測定。各農(nóng)藥組分定量離子的峰面積做為縱坐標(biāo)，各農(nóng)藥組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)工作曲線。以3 倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）。以3 個(gè)不同質(zhì)量濃度做加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)測定6 次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。獼猴桃中12 種農(nóng)藥質(zhì)量濃度為0.25～2 000 ng/mL 時(shí)，相關(guān)系數(shù)大于0.995 9，該方法檢出限為0.02～1.50 μg/kg。在不同添加量下，12 種農(nóng)藥平均回收率為61.5%～81.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～10.2%，試驗(yàn)結(jié)果可信。

12 種農(nóng)藥的線性特征、檢出限見表4，獼猴桃中12 種農(nóng)藥組分的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）見表5。

表4 12 種農(nóng)藥的線性特征、檢出限

表5 獼猴桃中12 種農(nóng)藥組分的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

基于QuEChERS 凈化前處理對(duì)獼猴桃中12 種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。相比于國標(biāo)方法GB/T 20769—2008，該方法簡便、快速、凈化效果好，有較好回收率，更加節(jié)約時(shí)間和成本，適用于獼猴桃中農(nóng)藥快速篩查，對(duì)推動(dòng)獼猴桃主要產(chǎn)區(qū)農(nóng)藥殘留調(diào)查有積極意義，還可進(jìn)一步探究其他水果蔬菜中農(nóng)藥快速檢測的可行性。