超聲波輔助提取水芹中總黃酮的工藝研究

萬國福，張 倩，謝雅薇，陳 文，田吉麒，張 蘭

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003）

水芹（Oenanthe javanica）又名水芹菜，別名水英、牛草、楚葵、刀芹、蜀芹、野芹菜等，屬于傘形科、水芹菜屬，為多年水生宿根草本植物。水芹含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、纖維素、蕓香苷、水芹素、檞皮素及黃酮類化合物等多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分[1]，對人體機體功能存在廣泛有益的影響。水芹味甘辛、性涼、入肺、胃經(jīng)，有清熱解毒、養(yǎng)精益氣、清潔血液、降低血壓、宣肺利濕等功效[2]，其中所含黃酮類化合物作為一種天然抗氧化劑，更具有抑菌、抗衰老和抗病毒等作用[3-4]。以水芹為原料，利用乙醇提取法提取總黃酮，通過分析超聲輔助干預(yù)處理的影響因素，運用SPSS Statistics 17.0 軟件進行正交試驗優(yōu)化最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

水芹，產(chǎn)地淮安。

1.1.2 試劑

蘆丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

UV754 型紫外可見分光光度計，北京普析儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9245A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍核儀器有限公司產(chǎn)品；高速粉粹機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；GN-100Y 型超聲波細胞粉碎機，上海谷寧儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 水芹總黃酮提取工藝

水芹→清洗→55 ℃烘干→打粉→樣品稱量→料液比配制→超聲波處理→離心取上清液→提取、測定。

1.3 總黃酮測定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確稱取烘干至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)品10 mg，加入適量體積分數(shù)70%的乙醇溶液中，水浴溶解，冷卻后用體積分數(shù)70%乙醇溶液定容至100 mL，配制得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL 的比色管中，依次加入體積分數(shù)70%乙醇溶液補足5 mL，加入質(zhì)量分數(shù)5%的亞硝酸鈉溶液0.1 mL，混勻后靜置5 min，再加入質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鋁溶液0.1 mL，搖勻后再靜置6 min，然后加入濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉溶液3 mL。最后用體積分數(shù)70%的乙醇溶液定容至10 mL，混勻，靜置10 min 后，于波長510 nm 處測定吸光度[3-5]。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 水芹黃酮提取與測定

在室溫條件下，準(zhǔn)確稱取1 g 的水芹干粉進行超聲波處理后，提取總黃酮并計算黃酮提取率。

式中：C——試樣的測定質(zhì)量濃度，mg/mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

n——稀釋倍數(shù)；

V——濾液體積，mL。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗

準(zhǔn)確稱量若干份水芹干粉1 g，分別以乙醇體積分數(shù)（30%，40%，50%，60%，70%），料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70），超聲功率（200，250，300，350，400 W），超聲時間（20，30，40，50，60 min）進行單因素試驗處理[6-8]，利用1.3 測定方法提取并計算黃酮提取率，研究各因素對水芹菜中總黃酮提取量的影響。

1.4.2 正交試驗

依據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，選擇各因素最佳處理條件設(shè)計L9（34）正交試驗。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分數(shù)的選擇

乙醇體積分數(shù)對水芹中總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對水芹中總黃酮提取率的影響

水芹中所含的黃酮類化合物極性較大，依據(jù)“相似相溶原理”極性溶劑乙醇的不同體積分數(shù)對黃酮類化合物提取有較大影響。由圖2 可知，水芹總黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)不斷增加，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為60%時，總黃酮提取率最高。因此，選擇水芹中總黃酮提取的最佳乙醇體積分數(shù)為60%。

2.2 料液比的選擇

料液比對水芹總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對水芹總黃酮提取率的影響

水芹干粉與水的混和比例對總黃酮提取也有較大影響。由圖3 可知，料液比總黃酮提取率與料液比之間呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，當(dāng)料液比為1∶40時，水芹中總黃酮提取率最高，伴隨水的加入量不斷增加即料液比逐漸變小，黃酮提取量也逐漸下降。因此，選擇水芹中總黃酮提取的最佳提取料液比為1∶40。

2.3 超聲功率的選擇

超聲功率對水芹總黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，在相同的超聲作用時間內(nèi)，當(dāng)超聲波功率由200～350 W 變化時，隨著超聲波功率的增加，總黃酮的溶出量越高，提取率也越高。當(dāng)超聲功率為350 W 時，水芹中總黃酮提取率達到最大值，若超聲波功率繼續(xù)增大，則總黃酮提取率開始呈下降趨勢。因此，選擇水芹中總黃酮提取的最佳超聲功率為350 W。

圖4 超聲功率對水芹總黃酮提取率的影響

2.4 超聲時間的選擇

超聲時間對水芹總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對水芹總黃酮提取率的影響

由圖5 可知，在一定條件下，當(dāng)超聲功率相同時，超聲時間越長，總黃酮的溶出量越高，提取率也越高。當(dāng)超聲作用時間達到50 min 時，水芹中的總黃酮提取率達到最大值，若繼續(xù)延長作用時間，總黃酮提取率則會出現(xiàn)微弱下降。因此，選擇水芹中總黃酮提取的最佳超聲時間為50 min。

2.5 黃酮提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲功率4 個因素利用SPSS Statistics 17.0 軟件進行正交試驗。

正交試驗結(jié)果見表2，正交設(shè)計方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交設(shè)計方差分析結(jié)果

由表2 可知，試驗4（A2B1C2D3）組合最好，直觀分析獲得的最佳試驗組合為A3B1C3D3，即乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲時間60 min，超聲功率400 W。各因素的影響次序為B＞D＞A＞C，即料液比＞超聲功率＞乙醇體積分數(shù)＞超聲時間。

由表3 可知，乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間和超聲功率4 個因素中，料液比和超聲功率2 個因素為差異極顯著，而乙醇體積分數(shù)和超聲時間2 個因素為差異顯著。從軟件分析結(jié)果可知，料液比對提取率影響最大，其次是超聲功率、乙醇體積分數(shù)和超聲時間，與直觀分析結(jié)果相一致。

將最佳試驗組合A3B1C3D3進行3 次重復(fù)驗證試驗，得到水芹總黃酮提取率平均值為0.874 mg/g。故最終選擇組合A3B1C3D3，即乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲時間60 min，超聲功率400 W 作為水芹中總黃酮超聲波輔助提取工藝的最佳條件。

3 結(jié)論

在室溫條件下，通過單因素試驗分析乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲功率4 個影響超聲波輔助提取總黃酮的因素，確定出各因素的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶40，超聲功率350 W，超聲時間50 min。在此基礎(chǔ)之上，進一步通過正交試驗對超聲波輔助提取水芹中總黃酮工藝條件進行優(yōu)化，得出最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲時間60 min，超聲功率400 W。在該工藝條件下水芹中總黃酮的提取率可達0.874 mg/g。