常用蕓香科柑桔屬藥材特征圖譜鑒別研究

楊曉東，曹斯瓊，何廣銘，周湘媛，吳輝強(qiáng)，鄧 韜，李國衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

枳實(shí)、枳殼、個(gè)青皮、四花青皮、陳皮、化橘紅均為蕓香科（Rutaceae）柑桔屬CitrusL.臨床常用中藥。枳實(shí)（酸橙）、枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種不同成熟度的果實(shí)[1]，個(gè)青皮、四花青皮、陳皮為蕓香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培變種的不同成熟度的果實(shí)或果皮[1]，化橘紅（柚）為蕓香科植物柚C.grandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮[1]。因其屬于同科同屬藥材，具有理氣健脾、化痰等相似功效[2]，且化學(xué)成分也以橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等黃酮類成分為主[3]，有較高的相似性，在價(jià)格波動(dòng)較大的情況下，常有摻雜或替代使用的情況出現(xiàn)。《中國藥典》2020年版中6種藥材均有各自成分的相關(guān)檢測方法，包括薄層鑒別和含量測定，但從提取方法到色譜條件各種藥材的測定方法均有差異，當(dāng)鑒定一個(gè)未知樣品時(shí)，如藥材粉末或配方顆粒，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)，鑒定過程繁瑣復(fù)雜。雖然6種藥材均有指紋圖譜等相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，但未在相同的條件下對其指紋圖譜進(jìn)行對比研究，鑒別過程同樣復(fù)雜繁瑣。因此，本實(shí)驗(yàn)將對上述6種藥材進(jìn)行特征圖譜研究，通過特征圖譜和相似度的比較，達(dá)到既可以鑒別藥材品種，又可以區(qū)分不同成熟度藥材的目的。

化學(xué)計(jì)量學(xué)方法已被廣泛應(yīng)用于中藥材鑒別和中藥材產(chǎn)地分析，他基于數(shù)學(xué)、化學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)的方法及原理，設(shè)計(jì)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)、處理并分析檢測數(shù)據(jù)信息，從而獲取復(fù)雜分析體系中隱含的信息[8]。普遍應(yīng)用的有主成分分析、聚類分析及偏最小二乘判別分析（orthogonal partialLeast aquaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）等。聚類分析是按樣品品質(zhì)特性的相似性使其成對逐漸聚合在一起，相似性較高的樣品優(yōu)先聚合在一起，從而完成聚類分析的過程[9]。通過聚類分析將6種藥材按相似性進(jìn)行聚類，達(dá)到區(qū)分橘、柚、橙3大類藥材的目的，并通過主成分分析進(jìn)行佐證。通過OPLS-DA法進(jìn)一步區(qū)分橘不同成熟度的果實(shí)或果皮。通過上述幾種方法對常用柑桔屬藥材進(jìn)行分類和質(zhì)量評價(jià)，為柑桔屬藥材的鑒定與質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

Waters ARC型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Waters Xselect HSS T3型（250 mm×4.6 mm，5 μm）；ME204E型萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；XP26型百萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（美國默克股公司）。甲醇為分析純，磷酸、乙腈為色譜純，水為超純水。

對照品新橙皮苷（批號111857-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.40%）、柚皮苷（批號110722-201714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.40%）、橙皮苷（批號110721-201818，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.20%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；對照品川陳皮素（批號18070602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）、橘皮素（批號18031501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）均由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供；蕓香柚皮苷（批號wkq19041908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、水合橙皮內(nèi)酯（批號wkq20031904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）均由四川省維克奇生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)所用藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，ZS1～ZS15號樣品蕓香科植物酸橙C.aurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果、ZQ1～ZQ15號樣品為蕓香科植物酸橙C.aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)、GQ1～ZQ13號樣品為蕓香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果、SH1～SH14號樣品為蕓香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)的果皮、CP1～CP14號樣品為蕓香科植物橘C.reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮、HJ1～HJ13號樣品為蕓香科植物化州柚C.sgrandis‘Tomentosa’的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，見表1。

表1 84批樣品信息Table 1 84 batches of sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，洗脫程序?yàn)?～30 min，15%～30% A；30～50 min，30%～60% A；50～55 min，60%～85% A；55～60 min，85% A；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為284 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、橘皮素對照品適量，加甲醇制成62.700、57.675、51.275、56.012、1.034、57.771、55.174 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，補(bǔ)充質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜方法學(xué)研究

2.4.1 精密度試驗(yàn) 分別取同一份個(gè)青皮（批號GQ1）和枳實(shí)（批號ZS1）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各自共有色譜峰的保留時(shí)間與峰面積RSD，結(jié)果均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一份個(gè)青皮（批號GQ1）和枳實(shí)（批號ZS1）供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。計(jì)算各自共有色譜峰的保留時(shí)間與峰面積RSD，結(jié)果均小于2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取個(gè)青皮（批號GQ1）、枳實(shí)（批號ZS1）平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定。以橙皮苷為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果各色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜分析及評價(jià)

2.5.1 特征圖譜的建立及共有峰歸屬 取15批枳實(shí)、15批枳殼、13批個(gè)青皮、14批四花青皮、14批陳皮、13批化橘紅藥材樣品，各約0.5 g，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將色譜信息導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行分析：枳實(shí)確定11個(gè)共有峰，枳殼確定10共有峰，個(gè)青皮共確定11個(gè)共有峰，四花青皮確定10個(gè)共有峰，陳皮確定9個(gè)共有峰，化橘紅確定6個(gè)共有峰，6種藥材特征圖譜共有峰見圖1。6種藥材的共有峰中4號峰（橙皮苷）分離度較好，響應(yīng)較高，為藥材中抗炎、抗氧化、抗菌、保護(hù)心血管系統(tǒng)的主要成分之一[10-11]，故以4號峰（橙皮苷）為參照峰（S峰）。經(jīng)與對照品色譜峰保留時(shí)間相比對和DAD光譜分析。共指認(rèn)出7個(gè)特征峰，分別為2號峰蕓香柚皮苷、3號峰柚皮苷、4號峰橙皮苷、5號峰新橙皮苷、6號峰水合橙皮內(nèi)酯、14號峰川陳皮素、15號峰橘皮素（圖2）。

圖1 6種藥材HPLC特征圖譜共有峰Fig.1 Common peaks in HPLC characteristic chromatograms of six medicinal materials

圖2 6種藥材樣品共有峰對照品歸屬Fig.2 Ascription of common peak reference substances in six kinds of medicinal materials samples

枳實(shí)藥材中主要成分為新橙皮苷，其次為柚皮苷[12]；枳殼中則是柚皮苷含量占主導(dǎo)地位[13]；個(gè)青皮、四花青皮、陳皮中黃酮類成分主要為橙皮苷[14]；化紅藥材中柚皮苷的含量占絕對主導(dǎo)地位。由特征圖譜可知橙比橘多1、3（柚皮苷）、5（新橙皮苷）、6（水合橙皮內(nèi)酯）和9號峰，橙比橘少7、8、10、13和16號峰；枳實(shí)比枳殼多11號峰；陳皮比個(gè)青皮少7、11號峰，四花青皮比個(gè)青皮少11號峰；化橘紅的色譜峰最少。通過特征圖譜色譜峰數(shù)量能明顯區(qū)分上述6種藥材。

“相似度評價(jià)系統(tǒng)”分別對ZS1～ZS15、ZQ1～ZQ15、GQ1～GQ13、SH1～SH14、CP1～CP14、HJ1～HJ13共84批藥材樣品HPLC特征圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，峰4（橙皮苷）為參照峰，采用平均數(shù)，時(shí)間窗口為0.2，自動(dòng)匹配，分別以枳實(shí)、枳殼、個(gè)青皮、四花青皮、陳皮、化橘紅共有模式作為對照特征圖譜，計(jì)算相似度系數(shù)，15批枳實(shí)藥材的相似度均在0.935以上，15批枳殼藥材的相似度均在0.926以上，13批個(gè)青皮藥材的相似度均在0.959以上，14批四花青皮藥材相似度均在0.864在上，14批陳皮藥材的相似度均在0.937以上，13批化橘紅藥材的相似度均在0.999以上（表2），結(jié)果表明，同一品種間的相似度較大。以枳實(shí)、枳殼、個(gè)青皮、四花青皮、陳皮、化橘紅的對照特征圖譜2組之間分別進(jìn)行相似度比較（表3）。由結(jié)果可知，6種蕓香科藥材對照特征圖譜兩組之間的相似度范圍為0.008～0.990，表明6種藥材間特征圖譜差異性較大。

表2 6種不同品種藥材樣品相似度評價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity evaluation results of six kinds of medicinal materials

表3 6種不同品種藥材對照特征圖譜相似度評價(jià)結(jié)果Table 3 Similarity evaluation results of characteristic chromatograms of six different varieties of medicinal materials

2.5.2 聚類分析 運(yùn)用SPSS 20.0軟件對84批藥材16個(gè)共有峰的相對峰面積為數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見圖3，當(dāng)判斷距離為20時(shí)，結(jié)果顯示84批藥材被分為3類。I類包括GQ1～GQ13、SH1～SH14、CP1～CP14，II類包括ZS1～ZS15、ZQ1～ZQ15，III類包括HJ1～HJ13，即橘不同成熟期的果實(shí)（個(gè)青皮、四花青皮、陳皮）歸為一類，橙（酸橙）不同成熟期的果實(shí)（枳實(shí)、枳殼）歸為一類，柚的果實(shí)（化橘紅）歸為另外一類；當(dāng)判斷距離為10時(shí)，ZS1～ZS15聚為一類，ZQ1～ZQ15聚為一類，HJ1～HJ13聚為另一類，即能將枳實(shí)、枳殼、化橘紅各單獨(dú)的聚為一類，個(gè)青皮、四花青皮、陳皮無法通過聚類分析進(jìn)行劃分。

圖3 聚類分析結(jié)果Fig.3 Result of cluster analysis

2.5.3 主成分分析 以84批樣品16個(gè)共有峰的相對峰面積為數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0軟件對其進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值和方差，見表4，碎石圖見圖4。結(jié)果顯示前4個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)87.347%，故選擇成分1、2、3和4作為第1、2、3和4主成分，可代表柑桔屬枳實(shí)、枳殼、個(gè)青皮、四花青皮、陳皮和化橘紅6種藥材特征圖譜共有峰的大部分信息。由碎石圖可知其特征值的變化情況，特征曲線有明顯拐點(diǎn)，說明前4個(gè)主成分代表了6種蕓香科柑桔屬藥材間的異同。初始因子載荷矩陣（表5），由結(jié)果可知，第1主成分主要體現(xiàn)色譜峰7、13、14、15（橘皮素）和16的信息，第2主成分主要體現(xiàn)色譜峰9的信息，第3主成分主要反映了峰3（柚皮苷）、11和12的信息，第4主成分主要反映了峰1和峰5（新橙皮苷）的信息，故4個(gè)主成分可表示特征圖譜的主要信息。計(jì)算各樣品之間的主成分得分（表6），不同的品種之間主成分得分差異較大，如枳實(shí)的主成分4得分最高；枳殼的主成分2得分最高；個(gè)青皮、四花青皮、陳皮的主成分1得分較高；化橘紅的主成分3得分最高。不同品種的主成分得分存在較大差異。

表4 主成分特征值及方差Table 4 Analysis of principal components and variance

表5 主要因子載荷矩陣Table 5 Main factor loading matrix

表6 主成分得分、綜合得分Table 6 Principal component score, sorting meter of comprehensive score

圖4 碎石圖Fig.4 Stone map

2.5.4 OPLS-DA 以個(gè)青皮、四花青皮、陳皮特征圖譜的10個(gè)色譜峰相對峰面積為變量對3種藥材進(jìn)行OPLS-DA分析。所建立的模型，R2X（cum）＝0.909，R2X（cum）＝0.817，Q2（cum）＝0.783，均大于0.5，說明該模型穩(wěn)定可靠，由圖5可知，該模型可將不同成熟期橘的果實(shí)個(gè)青皮、四花青皮、陳皮樣品分為3類，并從10個(gè)變量的VIP值圖（圖6）可知，以VIP＞1.0為顯著影響，共找到5個(gè)差異標(biāo)志物，其影響顯著性排序?yàn)榉?1＞峰10＞峰7＞峰8＞峰12，提示這幾個(gè)化學(xué)成分對于區(qū)分不同成熟期橘的果實(shí)個(gè)青皮、四花青皮、陳皮貢獻(xiàn)率較大。通過聚類分析能將橙、橘、柚3大類藥材單獨(dú)的聚為一類。能較好的區(qū)分不同成熟期橙的果實(shí)，但無法區(qū)分不同成熟期橘的果實(shí)，個(gè)青皮、四花青皮、陳皮每一類都存在著相互混淆的情況；其原因可能為蕓香科橘采摘期較難控制，如個(gè)青皮GQ4、GQ12、GQ1、GQ6被聚類到陳皮類，推測上述4批個(gè)青皮可能為接近成熟或成熟橘脫落的果實(shí)，通過觀察上述4批個(gè)青皮的藥材性狀時(shí)發(fā)現(xiàn)其果實(shí)較大，果皮顏色偏淺黃色，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測。四花青皮SH6、SH14、SH7、SH13和陳皮CP4、CP6、CP5、CP7、CP10、CP1被聚為一類，原因可能為這10批樣品的成熟度接近，或因?yàn)殚俚脑耘嘧兎N較多，這10批樣品屬于某個(gè)變種的果實(shí)。由主成分分析可知，不同品種之間的主成分得分存在差異，如枳實(shí)的主成分4得分最高，而峰1和峰5（新橙皮苷）對主成分4的貢獻(xiàn)率最大，由此推斷峰1和峰5（新橙皮苷）是影響枳實(shí)與其他蕓香科藥材區(qū)分的主要因素。同理推測峰9是影響枳殼與其他蕓香科藥材區(qū)分的主要因素；峰7、13、14（川陳皮素）、15（橘皮素）、16是影響橘（個(gè)青皮、四花青皮、陳皮）與其他蕓香科藥材區(qū)分的主要因素；峰3（柚皮苷）、11、12是影響化橘紅與其他蕓香科藥材區(qū)分的主要因素。通過OPLS-DA單獨(dú)分析不同成熟期橘的果實(shí)時(shí)，能將個(gè)青皮、四花青皮和陳皮明顯的區(qū)分出來。綜上所述，不同蕓香科藥材間存在一定的差異。

圖5 個(gè)青皮、四花青皮和陳皮的OPLS-DA分析Scores圖Fig.5 Scores diagram of OPLS-DA analysis of Fructus citri immaturus, Pericarpium Citri Reticulatae and Tangerine peel

圖6 10個(gè)色譜峰的OPLS-DA分析VIP圖Fig.6 VIP values of 10 chromatographic peaks by OPLS-DA analysis

3 討論

黃酮類成分作為蕓香科柑桔屬藥材中的活性成分，枳實(shí)中主要成分為新橙皮苷，枳殼中柚皮苷的含量最高，化橘紅藥材中柚皮苷的含量占絕對主導(dǎo)地位，青皮與陳皮藥材中橙皮苷的含量都為最高。不同柑桔屬藥材中黃酮類成分含量及種類均有顯著性差異，且隨著成熟度的增加，黃酮類成分的總量呈下降趨勢[15-16]。臨床藥效表明陳皮的理氣作用弱于青皮，枳殼的理氣作用弱于枳實(shí)。其原因可能與黃酮類成分的含量下降有關(guān)。

本研究建立的HPLC特征圖譜方法較全面地反映了蕓香科柑橘屬藥材的化學(xué)成分，分析方法簡便、準(zhǔn)確可靠，利用聚類分析和OPLS-DA可以準(zhǔn)確的區(qū)分上述蕓香科柑橘屬6種藥材，為蕓香科藥材資源的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突