羅紅霉素未知雜質(zhì)的分離鑒定與抗菌活性研究

孟祥燕 馮傳威 樊偉明 周煒祥 王建紅 劉小睿 沈永淼,*

(1 浙江震元制藥有限公司，紹興 312000；2 浙江理工大學理學院化學系，浙江省高分子材料表界面科學重點實驗室，杭州 310018)

紅霉素(erythromycin, EA)最初是由Lilly公司分離得到的首個大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物，是近半個世紀以來使用最廣泛的高效抗多數(shù)革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌的抗生素。主要由內(nèi)酯環(huán)、德糖胺和克拉定糖組成[1-2]。紅霉素在酸性條件下不穩(wěn)定，口服后易在胃酸作用下生成無抗菌活性的螺縮酮衍生物，生物利用率低[3]。為提高其穩(wěn)定性，人們對涉及反應(yīng)位點的C-6，C-9，C-11及C-12等進行結(jié)構(gòu)改造，抑制環(huán)合降解，合成了一系列半合成的紅霉素衍生物。

紅霉素可分為紅霉素A、B、C、D、E、F，其中紅霉素E的制備僅在1973年的美國專利(US3714142)中有報導[4]。紅霉素ABCDE均有一定的抗菌活性，但活性差異較大，紅霉素A是紅霉素的主要活性成分。紅霉素B在抗菌譜和抗菌活性上與A相似，但毒性為A的兩倍；紅霉素C不是活性物質(zhì)，因此B和C除了在發(fā)酵中需控制含量，后續(xù)處理時也應(yīng)除去，以提高活性物質(zhì)A的含量。紅霉素E(圖1)由于含量低，相關(guān)研究較少，抗菌活性僅為A的13%[5]，一般作為非活性物質(zhì)除去[6-7]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素E和羥胺反應(yīng)衍生化之后的產(chǎn)物—紅霉素E肟的抗菌活性也遠不如紅霉素A肟[8]。羅紅霉素雜質(zhì)G'這個雜質(zhì)以往是由紅霉素E經(jīng)一系列反應(yīng)形成的(圖2)，均直接歸類到羅紅霉素的未知雜質(zhì)組分中，目前僅有一篇文獻通過質(zhì)譜推測了其可能的結(jié)構(gòu)[9]，沒有明確的雜質(zhì)研究及活性研究，以往均作為非活性物質(zhì)通過結(jié)晶工藝除去，國家標準中要求其含量＜0.5%，額外的純化工藝增加了羅紅霉素的成本。

本文通過制備液相色譜對羅紅霉素雜質(zhì)G'進行有效分離提純，通過結(jié)構(gòu)表征確定了該雜質(zhì)為紅霉素E的衍生化產(chǎn)物，同時用前期確定結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)肟進行進一步衍生化反應(yīng)，同樣能得到羅紅霉素雜質(zhì)G'，進一步佐證了結(jié)構(gòu)的正確性。抗菌活性實驗結(jié)果顯示，該雜質(zhì)與羅紅霉素的抗菌活性相當，說明羅紅霉素雜質(zhì)G'有成為新型抗菌藥物的潛力，同時，對羅紅霉素的生產(chǎn)工藝來說，如果經(jīng)試驗證實羅紅霉素雜質(zhì)G'的毒性與羅紅霉素相當，在后續(xù)的生產(chǎn)中可降低羅紅霉素雜質(zhì)G'的質(zhì)控要求。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(GTXH-3000；安捷倫科技有限公司)，色譜柱(C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)，核磁共振譜儀(AVANCEⅢ-400M；瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司)，質(zhì)譜儀(Thermo LCQ Fleet spectrometer；美國熱電公司)，硅膠(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，二氯甲烷、氨水(薩恩化學技術(shù)有限公司)，甲醇(杭州高晶精細化工有限公司)，9-(E)-紅霉素A肟粗品及羅紅霉素粗品均來自于浙江震元制藥有限公司。

2 實驗方法

2.1 羅紅霉素雜質(zhì)G'的分離

2.1.1 從9-(E)-紅霉素A肟雜質(zhì)中分離

在前期的研究中已經(jīng)從9-(E)-紅霉素A肟的粗品中分離出9-(E)-紅霉素E肟[8]。本實驗將已經(jīng)純化的3 g 9-(E)-紅霉素E肟粗品溶解在12 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶劑中，升溫至全溶，然后用冰水降溫度至10℃以下，加入0.8 mL甲醇鈉甲醇溶液，攪拌，繼續(xù)降溫，在恒壓滴液漏斗中，加入約10 mL DMF和1-甲氧基-2-氯甲氧基乙烷0.52 g，當料液降溫至0℃以下，緩慢滴加，加完后攪拌，反應(yīng)結(jié)束后用醋酸調(diào)pH至6.5～7.5，將料液移至濃縮罐濃縮，控制內(nèi)溫小于65℃，至基本濃縮干后，加入3.0～5.0倍甲醇溶解，加入適量活性炭，保持溫度35℃～45℃脫色30 min以上，過濾，料液移至結(jié)晶罐中，用液堿調(diào)pH至10.5～11.5，再加入甲醇體積1.5～2.5倍的工藝用水進行結(jié)晶，將固體離心甩干，真空干燥得產(chǎn)量為2.2 g，經(jīng)液相色譜及質(zhì)譜檢測，羅紅霉素雜質(zhì)G'的產(chǎn)率為70%。

2.1.2 從羅紅霉素中分離

取2.05 g羅紅霉素樣品溶解于適量CH2Cl2通過制備液相色譜進行第一次分離，富集到純度為50%含量的羅紅霉素雜質(zhì)G'，然后再取500 mg 1次分離后的雜質(zhì)G'(50%左右含量)進行2次分離，所用的制備層析條件如下：固定相：硅膠(200～300目，廠家：煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；洗脫劑：體積比CH2Cl2:CH3OH:NH4OH=50:1:1；檢測波長：210 nm；流速：30 mL/min。

2.2 羅紅霉素雜質(zhì)G'的結(jié)構(gòu)確證

2.2.1 由前體肟的結(jié)構(gòu)間接確證

在前期發(fā)表的文章[8]中已經(jīng)報道了中間體雜質(zhì)肟的結(jié)構(gòu)。從該雜質(zhì)肟出發(fā)，通過醚化反應(yīng)，得到了羅紅霉素雜質(zhì)G'，由此間接確證了雜質(zhì)G'的結(jié)構(gòu)。

2.2.2 譜圖表征直接確證

從羅紅霉素粗產(chǎn)品中直接分離所得到的雜質(zhì)G'，通過IR、1H-NMR、13C-NMR、HRMS、2D-NMR等表征手段進行結(jié)構(gòu)確證。

2.3 抗菌活性研究

用微量稀釋法測定所分離的雜質(zhì)對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、草綠色鏈球菌以及白念珠菌)及革蘭陰性菌(大腸埃希菌)的最小抑菌濃度。本實驗采用微量液體二倍稀釋法確定化合物對各種細菌的最小抑菌濃度(MIC)[10]。

3 分析與討論

3.1 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析與鑒定

3.1.1 核磁共振波譜分析

將分離得到的羅紅霉素雜質(zhì)G'用CDCl3溶解，進行核磁共振波譜分析，其1H-NMR和13C-NMR譜圖見圖3～4，數(shù)據(jù)及歸屬見表1～2。

表1 羅紅霉素G' 1H NMR數(shù)據(jù)及歸屬Tab.1 The 1H-NMR date and assignment of the roxithromycin impurity G'

表2 羅紅霉素G' 13C NMR數(shù)據(jù)及歸屬Tab.2 The 13C-NMR dateandassignment of theroxithromycin impurity G'

3.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定

紅外吸收光譜在3433 cm-1：O-H伸縮振動；1106 cm-1：C-O伸縮振動；1106 cm-1：O-H面外彎曲振動，1632、1592 cm-1：C=N伸縮振動；2833 cm-1：-C-H伸縮振動；1358 cm-1：C-H彎曲振動。上述峰位顯示該雜質(zhì)中有-OH、C=N、飽和烷烴結(jié)構(gòu)，與羅紅霉素G' 結(jié)構(gòu)相符。同時，13C-NMR δ173.3 ppm的季碳峰也驗證存在C=N；13C-NMR δ170.0 ppm的季碳峰表明存在脂羰基結(jié)構(gòu)。除此之外1H-NMR、13C-NMR峰的化學位移與結(jié)構(gòu)一致，表明與羅紅霉素G'分子結(jié)構(gòu)吻合。HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+計算C41H75N2O16的分子量為851.5117，譜圖測得分子量為851.5105，與 G'分子式相符，同時在紫外光譜近紫外區(qū)沒有強吸收峰，表明該分子結(jié)構(gòu)中無共軛體系。

該結(jié)構(gòu)中的2、3、4、5、6、8、10、11、12、13、28、39、30、34、35、36和38位是手性碳，其中2位碳氫和3位碳氫發(fā)生偶合，偶合常數(shù)為10.7 Hz，推斷出2位H和3位H處于反式，都位于直立a健。其它手性碳構(gòu)型依據(jù)羅紅霉素G'反應(yīng)前體——羅紅霉素肟的單晶結(jié)構(gòu)推斷確定。從上述推斷可以得出羅紅霉素G'的結(jié)構(gòu)式(圖5)。

3.2 雜質(zhì)的抗菌活性研究

以羅紅霉素為參照物，對羅紅霉素雜質(zhì)G'進行了抗菌活性研究，結(jié)果(表3)顯示，羅紅霉素雜質(zhì)G'的抗菌活性與羅紅霉素相當，對肺炎球菌、草綠色鏈球菌的抗菌活性較好，對白念珠菌未顯示出抗菌作用，因此該雜質(zhì)有成為新型抗菌藥物的潛力。

表3 羅紅霉素雜質(zhì)G'的最低抑菌濃度Tab.3 The minimal inhibitory concentrations (MIC) of roxithromycin impurity G'

4 結(jié)論

本文通過液相色譜法來分離羅紅霉素中的一個主要未知雜質(zhì)羅紅霉素雜質(zhì)G'，然后通過1HNMR，13C-NMR、IR、HRMS等來確定未知雜質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)為紅霉素E衍生化產(chǎn)物，最后測試了該雜質(zhì)對金黃色葡萄球菌，肺炎球菌，大腸埃希菌，草綠色鏈球菌及白念珠菌的抗菌活性，與羅紅霉素比較發(fā)現(xiàn)兩者的抗菌活性相當。因此，認為通過對紅霉素E的結(jié)構(gòu)進行適當?shù)男揎椨型铣梢活愋滦涂咕幬铩Ｇ胰魞烧叨拘院腕w內(nèi)抗菌活性也相當，則在后續(xù)生產(chǎn)過程中可降低羅紅霉素G'的質(zhì)控要求，大大降低了生產(chǎn)成本。