MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析的應用研究

張杰 張金鑫 楚新旭 應沖濤 郭普 汪華學,*

(1 蚌埠醫學院第一附屬醫院重癥醫學科，蚌埠 233004；2 蚌埠醫學院第一附屬醫院疼痛科，蚌埠 233004；3 蚌埠醫學院第一附屬醫院檢驗科，蚌埠 233004)

近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛及不合理應用，引起耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率不斷增長，為臨床診療帶來了巨大的風險與挑戰[1-2]。通過分析CRKP的同源性，便于明確CRKP的流行病學分布和擴散方式，為臨床感染防控及疾病診療提供依據。脈沖場凝膠電泳(PFGE)作為現今最常用于鑒定細菌分型的分子生物學技術之一，通過分析菌株間的同源性，能夠有效識別院內CRKP引起的感染流行與暴發規律，但由于操作復雜、耗時、實驗條件苛刻等因素制約，常規醫療機構少有開展[3]。目前MALDI-TOF MS作為快速篩選菌株種屬的新工具，具有高通量、時效高、誤差小、性價比高等優勢，為診療提供強大的技術支撐[4]。MALDI-TOF MS除用于種屬鑒定外，也可用于在同源性的分析比較，通過質譜峰進行聚類分析便可快速監測耐藥菌株的流行病學分布，為耐藥菌株的院內感染控制提供指導意見[5]。本研究應用MALDI-TOF MS采集CRKP菌株的質譜圖，利用自帶的SARAMIS軟件分析菌株間的同源性，PFGE作為分組標準，旨在評價MALDITOF MS進行同源性分析的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收取某院2018年9月—2020年10月在微生物室分離自痰、血液、尿液及胸水等標本的肺炎克雷伯菌295株(除去同一病患相同部位的重復菌株)，其中分離自痰標本130株，血液標本62株，尿液標本27株，胸水標本31株，分泌物標本33株，腦脊液標本12株。科室來源見表1。質譜質控菌株：大腸埃希菌ATCC8739；標準菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。菌株均保存于-80℃冰箱中。

表1 295株肺炎克雷伯菌的科室來源Tab.1 The department source of 295 Klebsiella pneumoniae strains

1.1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS、48孔靶板及麥氏比濁儀購自法國Bio-Merieux公司，PFGE電泳儀及成像儀源自美國Bio-Rad公司；MH平板和哥倫比亞血瓊脂平板購自合肥天達試劑公司，CHCA基質液購自法國Bio-Merieux公司；美羅培南(10 μg)及亞胺培南(10 μg)藥敏卡片購自英國Oxoid公司；蛋白酶K和XbaI內切酶購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養及種屬鑒定

從-80℃冰箱選取保存的菌株，按三區劃線，接種至哥倫比亞血瓊脂平板上，放在37℃溫箱中過夜培養后，再次分純培養。挑取單一菌落，應用甲酸提取法萃取出菌株蛋白，取1 μL上清液滴至48孔靶板上，一菌兩孔，最后挑取ATCC8739單一菌落，均勻涂抹在中間靶孔上，用于圖譜校準。然后，分別加1 μL CHCA液覆蓋靶孔上，晾干后利用MALDITOF MS自帶的RUO系統，以線性、正離子模式，調整頻率50 Hz，在質荷比2000～20000 Da內收集圖譜。將得到的峰度與數據庫對比，重新鑒定至種水平。

1.2.2 耐藥表型分析

挑取單個純菌落，應用麥氏比濁儀配至0.5 CFU/mL的菌懸液，接種至MH平板，37℃溫箱中孵養16～18 h，結果參照2020版CLSI M100 30th藥敏標準執行，其中美羅培南或亞胺培南的抑菌圈直徑≤19 mm，篩選為CRKP。

1.2.3 PFGE分析

按照文獻[6]方法所述，將篩選出的CRKP菌株，挑取新鮮純菌落至緩沖液中，震蕩搖勻15s，制成4個麥氏濁度的菌液，通過裂解、洗膠、酶切、上樣，接著電泳獲得圖像，最后利用BioNumerics軟件分析同源性。結果根據文獻[7]判讀：①條帶完全一樣為同一型；②1～3個條帶有差異為同一型的不同亞型，表示高度有關；③4～6個條帶有差異定為不同型別，表示可能有關；④≥7個條帶有差異定散發菌株，表示不相關。

以PFGE同源性分析作為分組標準：①高度同源組：相似性＞85%；②中度同源組：相似性介于70%～85%；③低度同源組：相似性＜70%。

1.2.4 MALDI-TOF MS分析同源性

參照“1.2.1”方法獲取待分析CRKP的質譜圖，取2000～20000質荷比為分析區間，將數據導入SARAMIS軟件中，應用Taxonomy工具中的相似性分型和identical mass分型進行圖譜的分析比較。

2 結果

2.1 PFGE結果

經耐藥表型共篩選出55株CRKP；PFGE對其進行聚類分析，得出同源性分析樹狀圖(圖1)，PFGE的分型、檢出結果及菌株來源見表2。

表2 PFGE的分型、檢出結果及菌株來源Tab.2 Classification, detection results and source of PFGE

2.2 3組分析比較

2.2.1 高度同源組

本組大多數KPN菌株同源性高度集中，根據PFGE結果，相似性均＞85%(圖1)；采用SARAMIS軟件的identical mass分型(圖2A)，菌株大多集中分布于60%～80%，均屬于A型，且A1型identical mass部分高于80%(HF516、HF518、BY261、BY281),其中發現HF1676與同型KPN相比，在identical mass分型中差異性較大，對高度同源組造成了一定的影響。通過相似性分型發現(圖2B)，PFGE相似性大于85%的菌株同源性大多集中，大多A型菌株相似性＞80%，這與PFGE結果一致性較高，然而HF281和BY217為A型菌株，但在相似性分型卻小于70%，差異性較大。

2.2.2 中度同源組

該組PFGE同源性介于70%～85%之間，菌株分型主要屬于A型(圖1)，但菌株之間具有一定的差異。應用identical mass分型(圖3A)和相似性分型(圖3B)發現，主要菌株之間的identical mass＞70%，相似性＞85%，表明KPN之間同源性較高，這與PFGE結果嚴重不符，存在較大差異。

2.2.3 低度同源組

此組PFGE分析差異性較大，均＜70%，分型各自不同，屬于散發性(圖1)。采用identical mass分型(圖4A)和相似性分型(圖4B)分析同源性，顯示KPN之間identical mass＜70%，相似性＜80%，與PFGE分析相似，能較好體現菌株間的差別。

3 討論

肺炎克雷伯菌是常見的腸桿菌科細菌，常導致肺部、腸道、甚至血流等感染[8]。β-內酰胺類抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的首選抗菌藥物，而碳青霉烯類抗生素被認為是最后的選擇。但是，隨著臨床上抗生素的廣泛應用及不合理使用，碳青霉烯類的耐藥率呈上升趨勢[9]。CHINET監測發現2005—2018年KPN對美羅培南和亞胺培南的耐藥率從2.9%和3.0%增加到26.3%和25.0%，13年來增加約9倍[10]。因此，及時發現、有效控制CRKP的流行趨勢與暴發至關重要。

現今，臨床微生物實驗室在細菌同源性分析的方面主要以分子生物學分型居多，其中PFGE作為一直比較公認的分型技術，具有較高的精確度和穩定性[11-13]。但該技術由于操作繁瑣、耗時長、費用高等缺點，不作為臨床實驗室常規設備和技術手段。為了快速明確耐藥菌的分布與流行規律，醫院迫切需要一種能夠快速溯源、加強疾病防控的時效性和應對能力的新技術。近年來，MALDI-TOF MS作為一種快速鑒定病原菌種屬的新技術，能通過分析菌株間蛋白豐度的細小差異，達到快速分析細菌同源性的目的，進而追根溯源[14]。有研究發現[5]，利用MALDI-TOF MS篩選出CRKP的特征質量峰，應用自帶的Clinpro Tools 3.0軟件分析比較菌株間的特征質量峰，作為其同源性分析的鑒定標準。王璐等[15]研究利用MALDI-TOF MS收集臨床分離的CRKP菌株，通過自帶的SARAMIS軟件對待測菌株進行同源性分析，發現40株CRKP以A型為主，占85%(34/40)，認為該醫院存在以A型CRKP為主的流行傳播。在本研究中，運用SARAMIS軟件的分型工具，高度同源組identical mass大多介于60%～80%之間，分布較為集中，相似性＞80%，與PFGE分析基本相似，這在菌株一致性和非一致這兩方面上，均能較好得反映院內病原菌流行趨勢。然而，在中度同源組中，質譜分析結果與PFGE分析具有較大差異，這表明MALDI-TOF MS在同源性分析上具有一定的不穩定性。結果分析：PFGE的分型原理是通過電場的不斷變化，帶動不同菌株基因組DNA序列的泳動方向，形成電泳條帶，最終達到細菌分型的目的，其本質是微觀變化的宏觀顯示，但對于分析含有復雜DNA序列的菌株，易受到相互影響，并且PFGE操作繁瑣、耗時，電泳條帶易受到緩沖液的配制、電泳時間、電壓、操作者的技術水平等因素受限，且常規醫院少有配置有關設備[11]；PFGE作為本實驗研究目的的衡量標準，仍存在一定的局限性，后續實驗仍需通過其他常用分型技術驗證菌株分型結果的準確性；MALDI-TOF MS分析菌株間的同源性是基于病原菌的蛋白質表達豐度[16]，通過比對系統自帶的數據庫得出質譜峰結果，從而得出同源性結果，其結果受到臨床菌株來源、抗生素選擇壓力、實驗室環境、操作者的嫻熟水平及待測菌株活性等因素制約，某些菌體可能存在不表達或表達過多，導致SARAMIS軟件分析的準確性不高。在中度同源組分析中，根據PFGE分型結果，顯示菌株之間分型大多不同，且根據圖1的同源性樹狀圖發現，本組同源性大多介于70%～85%；應用SARAMIS軟件，identical mass分型分析同源性，只有編號HF6791、HF1285、HF2148這3個菌株介于70%～85%，而相似性分型大多＞85%，這與PFGE的同源性樹狀圖比較，不能較好顯示出不同亞型及型別之間的一致性和不同時期播散的差異性；對于同源性較高和較低的菌株，能大致進行分型初篩。

本研究將臨床分離的55株CRKP劃分為3組菌株：在高度及低度同源組分析中，對于菌株間的暴發流行與散發性，SARAMIS軟件能進行粗略的初篩；在中度同源組中，尚不適用；但該技術仍存在一定的不穩定性。由于本研究樣本量不多，其中部分菌株來源于同一科室，不能排除CRKP小范圍克隆傳播的可能，對實驗結果具有一定干擾性。并且，研究樣本的PFGE分型結果有限，僅限于監測菌株來源的院內流行趨勢，后續應收集不同菌株型別，探究質譜分析CRKP同源性的應用價值。此外，MALDI-TOF MS采集的質譜峰數量較多，部分存在不足，其中峰度干擾、噪聲、重復性低等因素均對分析結果造成一定的影響。因此，后續應當進一步增加研究對象的樣本量，擴大CRKP的菌株來源，從而完善MALDI-TOF MS分析CRKP同源性的穩定性和可重復性。

綜上所述，采用MALDI-TOF MS研究CRKP的同源性，在一定程度上能夠快速追根溯源，從而增強院內病原菌流行防控的時效性，但對于同源性復雜的實驗菌株，穩定性不高，其應用價值需進一步研究，仍需更準確的同源性分析技術明確流行規律，從而采取適當措施，嚴格控制進一步的暴發。