液相色譜-串聯質譜法測定香蕉中吡蟲啉的不確定度評定

賈映霞

（北京市產品質量監督檢驗研究院，北京 101300）

香蕉作為熱帶水果，屬于芭蕉科，位列聯合國糧食及農業組織制定的世界糧食作物榜的第4 位。同時，它還是世界經濟作物的第8 位。所有的熱帶水果中，香蕉的消耗量是世界上最高的。國內香蕉大多產自海南、兩廣、福建和云南[1-2]。香蕉含有大量維生素、膳食纖維等人體所需的營養物質，也含有少量生物活性成分，如多酚與黃酮等[3-4]。香蕉具有潤腸通便、改善代謝綜合征、治療腹瀉和抗氧化等保健功能[5-9]。在香蕉的種植過程中難免受到病蟲害的威脅，現階段防治香蕉病蟲害的主要手段是化學藥劑防護。吡蟲啉是一種硝基亞甲基類殺蟲劑，主要用于糧食作物以及果蔬防治蚜蟲等蟲害，其原理是破壞農業害蟲的煙酸乙酰膽堿酯酶受體，以達到麻痹害蟲神經從而使害蟲死亡的目的。吡蟲啉的使用會對糧食作物及果蔬造成不同程度的藥物殘留[10]。

《食品國家安全標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規定吡蟲啉的ADI 值是0.06 mg/kg bw，吡蟲啉在香蕉內的最大殘留限量為0.05 mg/kg[11]。該標準也規定了香蕉中吡蟲啉的檢測標準可參考《水果和蔬菜中450 種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 20769—2008）[12]、《水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測定 高效液相色譜法》（GB/T 23379—2009）[13]。

近年來，水果中農藥殘留超標的問題層出不窮，因此檢測結果的準確性非常重要。不確定度可評價實驗中各因素對測量結果準確度的影響。本研究以《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[14]和《水果和蔬菜中450 種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 20769—2008）[12]為依據，科學研究了測定香蕉中吡蟲啉含量的不確定度。明確實驗過程中對實驗結果產生影響的主要因素，以期為水果中吡蟲啉的準確測定提供參考，同時使本實驗室能更好地滿足《檢測和校準實驗室能力認可準則》（CNAS—CL01：2018）[15]中日常檢驗工作質量控制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉，購買于生鮮超市；甲苯、甲酸溶液（色譜純，Fisher 公司）；乙腈、甲醇（色譜純，沃凱公司）；氯化鈉（優級純）；無水硫酸鈉（分析純）；Sep-Pak Vac 氨基固相萃取柱（1 g，6 mL，安譜公司）。標準品：吡蟲啉標準品（100 mg，純度為98.00%，CHEM SERVCE）。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀串聯質譜聯用系統UPLCMS/MS-8050（日本島津）；N-EVAP112 氮氣吹干儀（美國Organomation 公司）；2323K 高速臺式冷凍離心機（德國Hermle 公司）；Milli-Q 高純水儀（美國Millipore 公司）；XP205 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；旋轉蒸發儀；SNMXZ1601精度勻漿器（美國OMNi 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備溶液配制（1 mg/mL）：準確稱取0.010 0 g 吡蟲啉標準品（100 mg，純度為98.00%）于10 mL 容量瓶內，加入甲醇溶液溶解樣品并定容，手動搖晃瓶身使其混合均勻。

標準工作溶液制備（1 μg/mL）：取標準儲備溶液0.1 mL 于100 mL 容量瓶內，加入甲醇溶液定容，搖晃均勻，備用。

標準系列工作曲線的制備：準備7個10 mL 容量瓶，分別取吡蟲啉標準工作溶液0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL 和0.80 mL。加入甲醇溶液定容到刻度，得到的溶液濃度分別為0.001 μg/mL、0.002 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.040 μg/mL 和0.080 μg/mL。

1.3.2 樣品前處理

向100 mL 離心管內加入20.00 g 香蕉樣品、40 mL 乙腈。以高速組織搗碎機進行1 min 的勻漿提取，搗碎機的轉速為15 000 r/min。加入5 g NaCl 進行1 min 的 勻 漿 提 取， 在3 800 r/min 條 件 下 離 心5 min，離心完成后，吸取20 mL 上清液，并于40 ℃水浴環境下旋轉濃縮至體積為1 mL 左右，待凈化。

在Sep-Pak Vac 柱中加入高度約2 cm 的無水Na2SO4，并將其放置在下方放有雞心瓶的支架上。在樣品加入前，要先使用甲苯與乙腈的混合物4 mL對固相萃取小柱進行清洗（甲苯與乙腈的體積比為1 ∶3）。待液面與Na2SO4的頂部持平，以較快的速度把樣品的濃縮液轉移到凈化柱內，與此同時替換為新雞心瓶接收液體。使用與前述體積比相同的甲苯與乙腈的混合液2 mL 對樣品瓶進行洗滌，共需洗滌3 次。洗滌完成后，將清洗液轉移至柱內。在柱上安裝容量為50 mL 的儲液罐，使用甲苯與乙腈的混合物25 mL 進行洗脫（甲苯與乙腈的體積比為1 ∶3）。在雞心瓶內混勻，在40 ℃的水浴環境中旋轉濃縮至0.5 mL 左右為止。濃縮液用氮氣吹干儀吹干后，快速加入水與乙腈的混合液1 mL 混合均勻（水與乙腈的體積之比為2 ∶3），用0.2 μm 的濾膜過濾，過濾結束后移至液相色譜-串聯質譜儀內進行測定[12]。1.3.3 液相色譜-串聯質譜測定條件

色譜柱：Atlantis T3，150 mm×2.1 mm，3 μm；流動相：A 為0.05%甲酸水，B 為乙腈；柱溫：40 ℃；進樣量20 μL；離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧壓：5 000 V；霧化氣壓力：0.483 MPa；氣簾氣壓力：0.138 MPa；輔助加熱氣：0.379 MPa；離子源溫度：725 ℃。

1.3.4 數學模型的建立

香蕉中吡蟲啉計算公式如下：

式中：x為被測樣品中吡蟲啉含量，mg/kg。Ci為樣品內待測組分的濃度，μg/mL。C0為空白樣品內待測組分濃度，μg/mL。V1為樣品提取液總體積，mL；V2為過凈化柱的樣品體積，mL；V3為樣品最終定容體積，mL；m為樣品質量，g。其中，Ci與C0是由標準曲線得到的。

2 結果與分析

2.1 不確定度主要來源

根據實驗過程和數學模型分析計算可知，香蕉中吡蟲啉測定的不確定度來源主要有標準溶液的配制、樣品前處理、標準工作曲線的擬合和重復性測量。

2.2 不確定度評定

2.2.1 標準溶液配制引入的不確定度

（1）由吡蟲啉標準物質引入的不確定度。根據吡蟲啉標準品證書提供信息，吡蟲啉標準品的純度為98.00%，擴展不確定度為0.5%，其服從正態分布。置信水平P=98%，包含因子k=2，是B 類評定，相對不確定度為：

（2）配制吡蟲啉標準工作液與制備系列曲線時量器校準引入的不確定度。在此過程中共用A 級10 mL容量瓶9 個，A 級1 mL 吸量管6 個，A 級5 mL 吸量管4 個，B 級2 mL 吸量管1 個，A 級100 mL 容量瓶2 個。玻璃量均具有一定的最大允差，按矩形分布規律估算其相對不確定度，結果如表1 所示[16]。由玻璃量具校準引入的相對不確定度為：

表1 標準工作溶液配制過程中量具校準引入的不確定度

2.2.2 樣品前處理引入的不確定度

（1）樣品稱量引入的不確定度。樣品稱樣量為20.00 g。查閱相關權威資料，得到質量允許差Δy為0.05 g，其置信水平P為99%。考慮為正態分布，包含因子k=2[17]。樣品稱量引入的不確定度為：

樣品稱量引入的相對不確定度為：

（2）樣品前處理量取溶液引入的不確定度。對樣品進行前處理使用的玻璃量器包括50 mL 的量出式量筒1 個、1 mL 的A 級單標吸量管1 個。查閱相關的國家標準可知50 mL 量筒（量出式）容量允差為0.5 mL，1 mL 單 標 吸 量 管（A 級）容 量 允 差 為0.040 mL，經過計算后引入的相對標準不確定度值分別為0.072 1、0.004 62。對樣品預處理時，量取溶液的過程中引入的相對不確定度為：

樣品的預處理過程中引入的不確定度為：

2.2.3 標準工作溶液的線性擬合引入的不確定度

在本實驗中采用標準工作曲線來校正樣品中吡蟲啉殘留量的大小。各濃度的標準溶液進行1 次測定，橫坐標代表吡蟲啉濃度，縱坐標代表峰面積，則標準曲線方程是Y=19 298 200x+6 952.79，R2=0.998 8，結果如表2 所示。

表2 標準曲線擬合結果

對香蕉試樣重復測定3 次，使用標準曲線對樣品中的吡蟲啉進行校準，可以得到x0=0.029 7，依據《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[18]可以得到由標準曲線引入的相對標準不確定度為：

式中：s為峰面積標準偏差；n為標準溶液測定次數；xi為標準溶液濃度，μg/mL；b為標準曲線斜率；p為試樣測定次數；x0為試樣內吡蟲啉的含量，μg/mL；x—為標準溶液濃度平均值，μg/mL。

2.2.4 重復性測量引入的不確定度

樣品的重復進樣引入的不確定度屬于A 類評定，該值代表儀器的重復性是否良好，其由表3 數據計算。則由重復性測量引入的相對標準不確定度為

表3 重復進樣測量結果

2.3 合成標準不確定度

通過計算可得，測定香蕉內吡蟲啉含量的合成標準不確定度為：

2.4 擴展不確定度

擴展不確定度U=合成標準不確定度×包含因子。其中，置信度P=95%，則k=2。因此，本實驗測得的相對擴展不確定度為：

樣品內吡蟲啉含量的最佳估計值，記作x，x=0.029 6 mg/kg，故對應的擴展不確定度為：

U=0.029 6×0.336 4=0.009 96 mg/kg

則香蕉中吡蟲啉測定結果為（0.029 6±0.009 96）mg/kg，k=2。

3 結論

本文以液相色譜-串聯質譜法為理論依據對香蕉內的吡蟲啉含量進行了詳細的測定，研究了不確定度來源，分析了主要來源對實驗結果的影響程度。結果顯示，實驗結果主要受到標準曲線擬合引入的不確定度的影響，標準物質溶液配制引入的不確定度對實驗結果存在輕微影響。因此，在檢測過程中要確保標準溶液曲線配制的準確性，增加標準曲線中各點的測定次數，保證標準曲線的相關性符合規定；在儀器方面，及時做好對照品的期間核查以及儀器設備的校準和檢定，為提高檢測結果的準確性，降低誤判風險提供保障。