液相色譜-串聯質譜法同時檢測魚中氯霉素類和硝基咪唑類藥物殘留

勇艷華

（大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧大連 116630）

氯霉素類藥物為廣譜抗生素，具有良好的抗菌能力，被廣泛應用于水產養殖。氯霉素類藥物的毒副作用主要表現為對血液系統造成的毒性。硝基咪唑類藥物有致突變性和潛在的致癌性，很多國家已將其列為違禁藥物。歐盟在20 世紀90 年代已經禁止洛硝噠唑、地美硝唑和甲硝唑用于可食用動物，2002 年美國食品與藥物管理局又公布了11 種禁止在進口動物源性食品中使用的藥物名單，其中包括硝基咪唑類藥物。我國農業部和國家藥品監督管理局第227 號公告中規定，甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑不允許以促進動物生長為目的在所有食用動物飼養過程中使用。農業部公告第235 號文件規定，水產品中氯霉素、甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝唑均不得檢出，但是甲砜霉素在魚肉中限量50 μg/kg，氟苯尼考在魚肉中限量1 000 μg/kg、在其他動物肌肉中為100 μg/kg。

氯霉素類藥物的檢測方法有很多，分別為酶聯免疫法、液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯質譜法和液相色譜-串聯質譜法，現在普遍使用液相色譜串聯質譜法[1-11]。檢測硝基咪唑類及其代謝物的方法有酶聯免疫法、高效液相色譜法，主要采用液相色譜-串聯質譜法[12-18]。但同時檢測水產品中氯霉素類和硝基咪唑類及其代謝物的報道較少，標準《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T 3235—2012）中雖然包含了氯霉素和5 種硝基咪唑類物質，但未包含甲砜霉素和氟甲砜霉素，且需堿化乙腈、酸化乙腈各提取1 遍，略顯煩瑣，此外使用的提取試劑乙腈毒性較強[19]。本文建立了同時檢測氯霉素族和硝基咪唑類藥物殘留的液相色譜-串聯質譜分析方法，采用毒性較小的乙酸乙酯為提取試劑，進行液液萃取，正己烷脫脂，檢出限可達到要求，重復性好、準確度高、操作簡便，可滿足魚肉中兩類藥物殘留的檢測要求，適合用于生產、流通、餐飲及進出口環節的質量監管。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜儀（1290/6495，美國Agilent公司）；均質機（德國IKA 公司）；旋轉蒸發儀（瑞士Buchi 公司）；CF16RXII 立式大容量高速離心機（日本Hitachi 公司）；賽多利斯全自動超純水機（ 德 國Sartorius 公 司）；Agilent poroshell 120 ECC18色譜柱（4.6 mm×50.0 mm，2.7 μm，美國Agilent公司）。

實驗中甲醇、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純；實驗用水為超純水；無水硫酸鈉為分析純；甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑-D3、氯霉素、氯霉素-D5、氟甲砜霉素和甲砜霉素均為Dr.E 公司生產，純度大于98%。

1.2 標準溶液的配制

氯霉素類：分別稱取氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素標準品約0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液。準確吸取各標準儲備液0.1 mL 于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為1 μg/mL 的混合標準溶液。

硝基咪唑類：分別稱取甲硝唑、地美硝唑、洛硝達唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑標準品約0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液。準確吸取各標準儲備液0.1 mL 于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為1 μg/mL 的混合標準溶液。

氘代內標：分別稱取氯霉素-D5 和羥甲基甲硝咪唑-D3 標準品0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于100 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為100 μg/mL 的內標標準儲備液。準確吸取內標標準儲備液各0.1 mL 分別置于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為100 μg/L 的內標標準溶液。

取適量氯霉素類、硝基咪唑類混合標準溶液和內標標準溶液，用20%甲醇逐級稀釋至氯霉素類的濃 度 為0.5 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L；硝基咪唑類的濃度為2.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、60.0 μg/L 和100.0 μg/L；內含5.0 μg/L 氯霉素-D5 和20.0 μg/L 羥甲基甲硝咪唑-D3。

1.3 樣品前處理

稱取5.00 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于50 mL 離心管中，加入20 μL 羥甲基甲硝咪唑-D3標準中間液、5 μL 氯霉素-D5 標準中間液、25 mL乙酸乙酯及適量無水硫酸鈉，均質1 min，12 000 r/min高速離心，將上清液轉移至圓底燒瓶中，再加入25 mL 乙酸乙酯重復提取1 次，合并提取液至圓底燒瓶中，減壓旋轉蒸發至近干。1 mL 純水定容，2 mL正己烷脫脂，渦旋1 min，取水層過0.2 μm 微孔有機濾膜，待測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18；柱溫：30 ℃；流動相：A 為純甲醇，B 為高純水；梯度洗脫程序：0 ～1.5 min（25%A），1.5 ～4.1 min（25%～100%A）；4.1 ～6.5 min（100%A）；6.5 ～6.6 min（25%A）；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL。

1.4.2 質譜參數

電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；掃描方式：正負同時掃描；毛細管電壓：3 500 V；監測方式：多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源溫度：200 ℃；去溶劑氣溫度：300 ℃；去溶劑氣：氮氣13 L/min；錐孔氣：氮氣12 L/min。其他參數詳見表1。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的選擇

利用空白基質加標考察回收率，對提取試劑乙腈、甲醇和乙酸乙酯進行篩選，實驗結果表明，3 者在回收率上無明顯差異，乙酸乙酯毒性較小，確定其為本實驗的提取試劑。提取后，用正己烷脫脂，可提高回收率。

2.2 流動相的選擇

氯霉素類藥物和硝基咪唑類的結構決定了其可以在C18色譜上獲得分離。本實驗探討了甲醇和乙腈對目標化合物的洗脫效果，實驗結果表明，兩者均能較好地分離表1 中的10 種物質，但考慮到價格和毒性等因素，最終選擇甲醇；氯霉素類為負模式采集，酸抑制負模式的電離，影響靈敏度，因此最終確定流動相為純甲醇和高純水。在1.4.1 所述梯度洗脫條件下，在8 min 內可獲得這10 種物質的最佳峰形，達到快速分析的目的。

表1 氯霉素類和硝基咪唑類化合物質譜檢測參數及液相保留時間

2.3 線性范圍及檢出限

氯霉素類和硝基咪唑類分別在0.5 ～50.0 μg/L和2.0 ～100.0 μg/L 濃度與峰面積成線性相關，線性方程及相關系數見表2。利用低濃度添加回收確定本方法氯霉素類檢出限為0.1 μg/kg，硝基咪唑類檢出限中甲硝唑為0.5 μg/kg，其他均為1.0 μg/kg。

表2 氯霉素類和硝基咪唑類化合物線性方程和相關系數

2.4 回收率和精密度

用空白魚肉基質進行加標試驗，采用標準曲線內標法計算測定結果，以測定值對理論添加量的百分比表示回收率。每個添加水平進行6 次平行實驗，測定值的相對標準偏差表示方法精密度，結果見表3。由表可知，8 種物質的加標回收均能滿足檢驗需要。

表3 回收率及相對標準偏差（n=6）

2.5 實際樣品分析

利用本方法對市場銷售的50 余份魚進行檢測，其中，1 份魚肉中檢出氯霉素0.32 μg/kg，1 份魚肉中檢出甲硝唑5.21 μg/kg，其他樣品均未檢出。

3 結論

本文建立了同時檢測魚肉中3 種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物殘留的高效液相色譜-串聯質譜方法，此方法快速、高效、準確，便于操作，可用于魚肉中3 種氯霉素類和5 種硝基咪唑類藥物殘留的日常檢測。