液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中禁用獸藥五氯酚酸鈉測(cè)量不確定度評(píng)定

楊 柳，許瑞清，崔小芳，劉建春

（1.山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西太原 030032；2.山西錦爍生物醫(yī)藥科技有限公司，山西晉中 030600）

五氯酚酸鈉即五氯酚鈉，可用作落葉樹休眠期噴射劑，以防治褐腐病，也用作除草或殺蟲劑[1]。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250 號(hào)公告將五氯酚酸鈉列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo U3000-AB seicx 4500Qtrap 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；P-SAX 固相萃取柱（60 mg/3 mL），月旭科技(上海)股份有限公司；UW620H 電子天平，日本島津公司。

五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，由壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供）；乙腈、甲醇均為質(zhì)譜級(jí)。

采用GB 23200.92—2016[2]進(jìn)行測(cè)量。由同一檢驗(yàn)員在相近的時(shí)間內(nèi)，對(duì)同一份豬肉樣品測(cè)定10 次，對(duì)測(cè)量結(jié)果評(píng)定測(cè)量不確定度。

1.2 檢測(cè)方法

稱取均質(zhì)試樣2 g，置于10 mL 聚丙烯離心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液，均質(zhì)提取2 min。3 000 r/min 離心5 min，收集上清液于離心管中。重復(fù)上述提取步驟1 次，合并上清液，混勻。將提取溶液轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的MAX 固相萃取柱中，1 滴/s 流速使樣液全部通過固相萃取柱，棄去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL 甲醇、5 mL 2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗，棄去流出液，抽干固相萃取柱5 min 以上。以4 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液收集于10 mL 具刻度試管，40 ℃水浴下氮吹至1 mL，用水定容至2 mL，混勻。過0.22 μm 濾膜，供測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

采用吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 定容至10 mL 容量瓶中的方法，2 級(jí)稀釋配制成10 ng/mL 的五氯酚酸鈉中間使用液，依次吸取相應(yīng)體積置于10 mL容量瓶中，用基質(zhì)液定容，配成0 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL 和5.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作系列。

1.4 儀器條件

（1）色譜條件。SHISEIDO CAPCELL PAK MG III C18（150 mm×2.0 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇+5 mmol/L 乙酸銨溶液（60+40），等度洗脫；流速：300 μL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；定量離子對(duì)：262.7 ＞262.7，定性離子對(duì)：264.7 ＞264.7、266.7 ＞266.7、268.7 ＞268.7。

1.5 測(cè)量過程

用液相色譜質(zhì)譜儀測(cè)定工作標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。待測(cè)樣液注入儀器測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量，得出樣液濃度。

2 測(cè)量結(jié)果分析

2.1 建立測(cè)量數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測(cè)量過程建立測(cè)量數(shù)學(xué)模型：

式中：xi為試樣中待測(cè)物含量，μg/kg；ci為樣液中待測(cè)物的濃度，ng/mL；V為試樣經(jīng)處理后定容體積，mL；m1為試樣的質(zhì)量，g。

2.2 重復(fù)性測(cè)量結(jié)果

在相近的時(shí)間內(nèi)，由同一操作人員對(duì)樣品測(cè)量，10 次 測(cè) 定 結(jié) 果 分 別 為0.210 μg/kg、0.188 μg/kg、0.186 μg/kg、0.200 μg/kg、0.203 μg/kg、0.199 μg/kg、0.190 μg/kg、0.208 μg/kg、0.203 μg/kg 和0.184 μg/kg，平均值x—=0.197 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.009 39。

3 測(cè)量不確定度評(píng)定

3.1 測(cè)量重復(fù)性引入的測(cè)量不確定分量

3.2 工作曲線變動(dòng)性的不確定度分量

標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液分別進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，數(shù)據(jù)處理見表1。

根據(jù)表1 中的測(cè)試數(shù)據(jù)，用最小二乘法擬合線性回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程：y=356 880x+44 868，b=356 880，a=44 868，R=0.998 5。由工作曲線變動(dòng)性引起被測(cè)量溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)量參數(shù)

式中：n為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)量次數(shù)，n=18；P為樣品溶液測(cè)量次數(shù)為工作曲線各校準(zhǔn)濃度的平均值

被測(cè)樣品平均含量為0.197 μg/kg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線待測(cè)物濃度為則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(c)1=0.961，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度的不確定度分量

五氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書（編號(hào)91098b，唯一標(biāo)識(shí)21090491）給出相對(duì)擴(kuò)展不確定度為U=kurel(c)=0.02（k=2），因此urel(c)2=0.01。

3.4 定容體積引起的不確定度分量

10 mL 離心管定容至2 mL，依據(jù)JJG 10—2005[3]其允許誤差為±0.2 mL，其允差不確定度按均勻分布計(jì)算為不考慮過程中由溫差引起的不確定度。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V)=0.115，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.5 取樣量引入的不確定度分量

3.6 合成不確定度

上述各分量互不相關(guān)，按照不確定度傳播率公式計(jì)算相對(duì)合成不確定度

標(biāo) 準(zhǔn) 合 成 不 確 定 度 為u(x—) =0.197×0.665=0.131 μg/kg。

3.7 擴(kuò)展不確定度

取95%置信概率，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=ku=2×0.147=0.262 μg/kg。

4 測(cè)量不確定度報(bào)告

用液相質(zhì)譜法測(cè)定豬肉試樣中五氯酚酸鈉測(cè)量不確定度報(bào)告為x=0.197[-0.065,0.459] μg/kg，k=2。采用經(jīng)典方法調(diào)整，用液相質(zhì)譜法測(cè)定豬肉試樣中五氯酚酸鈉測(cè)量不確定度報(bào)告為x=0.197[0,0.491] μg/kg，k=2。

5 結(jié)論與討論

禁用藥物是常見食品檢測(cè)項(xiàng)目，其測(cè)量值低，接近于零，即使為負(fù)數(shù)也是合理的，可以按照GUM 法對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定，報(bào)告時(shí)對(duì)報(bào)告值加以修正，本研究采用經(jīng)典方法加以修正[3-4]。

5.1 經(jīng)典方法確定擴(kuò)展不確定度區(qū)間

經(jīng)典方法直接將擴(kuò)展不確定度區(qū)間從零開始調(diào)整，這樣測(cè)量不確定度則為不對(duì)稱區(qū)間，如圖1 中（d）[5]。測(cè)量值低于0 時(shí)，將測(cè)量值與測(cè)量區(qū)間同時(shí)調(diào)整，如圖1 中（b）（c）。圖1 中（a）則調(diào)整為0[0,0]，k=2。

圖1 經(jīng)典方法接近于零的擴(kuò)展不確定度區(qū)間情況

5.2 各分量測(cè)量不確定度分析

評(píng)定中各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量說明：A 類評(píng)定為測(cè)量重復(fù)性、工作曲線變動(dòng)性；B 類評(píng)定為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、定容體積和取樣量。本研究所建立的測(cè)量評(píng)定方法，工作曲線變動(dòng)性引入測(cè)量不確定度貢獻(xiàn)最大，貢獻(xiàn)率為88.88%。