基于GEO 數(shù)據(jù)庫探索miRNA 靶基因通過泛素化參與食管鱗狀細胞癌

靳 步，袁 穎，陳婉玉，徐滸東，黃曉蕾，何佳璐，于 紅

上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院，上海市嘉定區(qū)江橋醫(yī)院病理科，上海 201803

食管癌（esophageal cancer，EC）是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，全球每年約有60萬例癌癥病例，它是第七大最常見癌癥和第六大最致命癌癥［1］。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency on Cancer Research，IARC）的估計，2012年，世界范圍內(nèi)有45.58萬例新病例和40.02萬例死亡病例［2］。食管癌的發(fā)病率因地理區(qū)域的不同而有很大差異，多發(fā)生于發(fā)展中國家，中國的食管癌患者約占全球食管癌患者總數(shù)的一半［3］。傳統(tǒng)上，EC分為鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESCC） 和 腺 癌 （esophageal adeno carcinoma，EAC）。在中國，90%的病例是ESCC［2］。ESCC的早期診斷和治療的臨床方法仍然有限，大多數(shù)患者被診斷為晚期，2種組織學類型的生存率都很低。全球5年生存率為15%～25%［4］。因此，迫切需要了解ESCC的分子機制。

miRNA是一類小型非編碼RNA，介導基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在生理和病理過程中起著不可替代的作用。它們結(jié)合到目標mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）促進mRNA降解和/或抑制翻譯。在過去的10年中，在包括ESCC在內(nèi)的許多癌癥中，miRNA通過調(diào)控癌基因或抑癌因子的表達，在腫瘤細胞的生長和分化中發(fā)揮著重要作用［5］。

本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫選取2 個ESCC 患者血清miRNA芯片數(shù)據(jù)集，根據(jù)篩選出的差異表達miRNAs（differentially expressed miRNAs，DEMs）預測了相應的靶基因，并對靶基因進行基因本體（Gene Ontology，GO） 分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析和蛋白質(zhì)相互作用分析（protein-protein interaction，PPI），鑒定出5個樞紐（Hub）基因，結(jié)果顯示Hub基因或通過泛素化參與ESCC的疾病過程。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究分析的基因表達數(shù)據(jù)集來源于GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。從數(shù)據(jù)庫中檢索到2 365 篇有關(guān)人類食管癌的文獻。我們選擇了2 個miRNA 表達譜（GSE122497，GSE164174）。GSE122497包含5 531個樣本的血清miRNA 譜，其中包括566 個ESCC 樣本和4 965 個非癌對照樣本。GSE164174 包含2 940 個樣本的血清miRNA 譜，其中包括1 423 個胃癌，1 417 個非癌對照，50 個ESCC和50個結(jié)直腸癌，本研究僅納入ESCC組和非癌對照組。表達譜均基于Toray Industries GPL21263 平臺（3D-Gene Human miRNA V21_1.0.0）。Hub 基因組織間表達差異數(shù)據(jù)來源于GEPIA 網(wǎng)站公開數(shù)據(jù)（http：//gepia.cancer-pku.cn）。所有的數(shù)據(jù)都可以在網(wǎng)上免費獲得，而且這項研究沒有涉及任何在人類或動物身上進行的實驗。

1.2 數(shù)據(jù)處理與DEMs的篩選

采用GEO2R在線分析工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）與韋恩圖在線工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選差異基因并可視化。打開GSE122497數(shù)據(jù)集網(wǎng)頁（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE122497），點擊網(wǎng)頁下方“Analyze with GEO2R”，點擊“Define groups”，在空白框中輸入“ESCC”和“Control”作為ESCC組和正常組，點擊選擇下方樣本數(shù)據(jù)，再點擊上方分組名稱即可將數(shù)據(jù)納入分組。點擊網(wǎng)頁下方“Analyze”，下載表格，得到ESCC患者與健康受試者血清中miRNA譜之間的差值，計算調(diào)整后的P值和|logFC|。調(diào)整后的P<0.01，|logFC|≥2的miRNA視為差異表達miRNA。

以相同方法對GSE164174 數(shù)據(jù)集進行統(tǒng)計分析，將數(shù)據(jù)集的DEMs分別復制到新的文本文檔中，并上傳到韋恩圖在線工具網(wǎng)站，點擊“Submit”得到數(shù)據(jù)集相交的DEMs和韋恩圖圖像。

1.3 預測DEMs的靶基因

通過在線軟件TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_71/） 和 DIANA Tools （http：//diana. imis.athena-innovation. gr/DianaTools/index. php？ r=site/page&view=software）預測靶基因并取2 個網(wǎng)站的交集。由于TargetScan 不能批量復制DEMs，所以打開TargetScan 后，將每個DEM 分別逐一粘貼至搜索框中，將靶基因結(jié)果逐一復制至Excel 表格中，預測結(jié)果的交集獲得DEMs 的靶基因。打開DIANA Tools后，點擊microT-CDS 模塊，批量復制DEMs 后點擊“Submit”下載表格。將2 個在線軟件預測得到的靶基因利用韋恩圖在線網(wǎng)站取交集。

1.4 靶基因的GO 和KEGG 通路分析及GSEA驗證

GO 分析是大規(guī)模基因功能富集研究的常用方法，可分為生物過程（biological process，BP）、分子功 能 （molecular function， MF） 和 細 胞 成 分（cellular component，CC）。KEGG 是一個廣泛使用的數(shù)據(jù)庫，它存儲了大量關(guān)于基因組、生物途徑、疾病、化學物質(zhì)和藥物的數(shù)據(jù)。本研究使用DAVID 工具（https：//david.ncifcrf.gov/）對靶基因進行GO 注釋分析和KEGG 通路富集分析。使用miEAA 在線工具（https：//ccb-compute2.cs.uni-saarland.de/mieaa2/） 對KEGG 分析進行驗證：點擊網(wǎng)頁“Run miEAA”，選擇GSEA 模式，輸入DEMs 后選擇KEGG 選項，點擊“Submit”得到表格結(jié)果。

1.5 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建、 Hub 基因鑒定及GeneMANIA Cytoscape驗證

利用交互基因檢索工具（STRING） 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）對PPI 信息進行分析。為了評估潛在的PPI 關(guān)系，我們將之前鑒定的靶基因映射到STRING 數(shù)據(jù)庫中。打開STRING 選擇Multiple proteins，輸入DEMs，種屬選擇“Homo sapiens”，點擊SEARCH，利用Cytoscape 中的CytoHubba 插件計算每個蛋白節(jié)點的程度。連接度越高的節(jié)點對維持整個網(wǎng)絡的穩(wěn)定性越重要，我們選擇連接度最高的前5 名的基因作為Hub 基因。在Cytoscape 軟件中安裝CytoHubba 插件，選擇待分析的網(wǎng)絡后點擊Calculate和TOP10篩選連接度前10名的基因。

驗 證 使 用 GeneMANIA Cytoscape （http：//genemania.org/）在線工具，選擇人類種屬后，輸入Hub 基因得到基因-基因功能交互網(wǎng)絡。生成的網(wǎng)絡包括與原始列表最相關(guān)的基因以及來自Gene Ontology的功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 DEMs

以P<0.01 和|logFC|≥2 為標準，從GSE122497 中共鑒定出894 個DEMs，其中上調(diào)的miRNA 有33 個，下調(diào)的miRNA 有861 個。在miRNA 芯片GSE164174中，共鑒定出150 個差異表達的miRNA，其中27 個上調(diào)，123 個下調(diào)。通過比較ESCC 患者和正常患者的血清樣本來鑒別所有的DEMs，然后進行韋恩分析，得到DEMs 的交集。結(jié)果顯示，共有108 個DEMs，其中15 個顯著上調(diào)（圖1A），93個顯著下調(diào)（圖1B）。

圖1 韋恩圖顯示2個GEO數(shù)據(jù)集的DEMsFig1 Venn diagram showing DEMs of two GEO datasets

2.2 靶基因

TargetScan 預測10 674 個靶基因。microT-CDS 預測了515 001 個靶基因，最終以miTG 評分大于0.99的條件確定了1 764 個靶基因。將2 個軟件的預測結(jié)果進行交集，得到1 354個靶基因（圖2）。

圖2 韋恩圖顯示同時被TargetScan 及microT-CDS 預測到的靶基因Fig2 Target genes predicted by both TargetScan and microT-CDS

2.3 靶基因功能富集分析及驗證

利用DAVID 進行GO 功能和目的基因KEGG 通路富集分析，使用miEAA 在線工具進行GSEA 驗證。GO 分析結(jié)果表明，在BP term 中靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物過程。分子功能分析表明，靶基因在蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合、DNA 結(jié)合、鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合等方面顯著富集。在細胞組分中，靶基因富集于細胞核、細胞質(zhì)、核質(zhì)、突觸等部位（圖3A）。此外，KEGG 通路分析結(jié)果顯示，靶基因主要富集于腫瘤通路、MAPK信號通路、干細胞多能性調(diào)控信號通路等（圖3B）。GSEA驗證結(jié)果顯示靶基因富集與KEGG分析結(jié)果相似（圖3C）。

圖3 靶基因功能富集分析Fig 3 Functional enrichmeWnt analysis of target genes

2.4 靶基因PPI網(wǎng)絡分析及驗證

利用STRING 工具預測靶基因之間的蛋白質(zhì)相互作用。PPI 網(wǎng)絡共有1 326 個節(jié)點，2 300 條邊，平均節(jié)點連接度為3.47（圖4A）。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡節(jié)點的連接程度，篩選出前10 位的基因（圖4B）。結(jié)果表明，SMAD 特異性E3 泛素蛋白連接酶2（SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2，SMURF2）是連接度最高的基因，其次是β-轉(zhuǎn)導重復蛋白E3 泛素蛋白連接酶（β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，BTRC）、SMAD 特異性E3 泛素蛋白連接酶1（SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1，SMURF 1）、泛素結(jié)合酶E2 D1（ubiquitin conjugating enzyme E2 D1，UBE2D1）、E3 泛素連接酶枯靈素2（cullin 2，CUL2）、E3 泛 素 連 接 酶 枯 靈 素3 （cullin 3，CUL3）、含7 的F-盒和WD 重復結(jié)構(gòu)域（f-box and WD40 repeat domain containing 7）、細胞分化周期蛋白27 （CDC27）、 BTB 結(jié) 構(gòu) 域7 （BTB domain containing 7，KBTBD7）和含錨蛋白重復序列和細胞因子信號抑制物盒蛋白質(zhì)家族7 （human ankyrin repeat and SOCS box containing protein family 7，ASB7）。我們選擇前5 位的基因SMURF2、BTRC、SMURF 1、UBE2D1、CUL2作為Hub 基因（圖4B），以往的研究結(jié)果顯示，這些基因均與蛋白質(zhì)的泛素化有關(guān)［6-9］。GEPIA 網(wǎng)站顯示了它們在ESCC 組織中與正常組織中的表達差異（圖4C）。我們使用GeneMANIA Cytoscape分析了與Hub基因有關(guān)的基因相互作用關(guān)系（其中不包含Hub 基因），結(jié)果顯示SMAD 家 族 成 員2 （SMAD family member 2，SMAD2）、酪氨酸3/色氨酸5 單加氧酶激活蛋白ζ（recombinant tyrosine 3/tryptophan 5 monooxygenase activation protein zeta，YWHAz）、叉頭框蛋白O3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（Phosphatidylinositol 3-kinase，PIK3CA）等與Hub基因有關(guān)的基因之間相互作用密切。

圖4 靶基因PPI網(wǎng)絡分析Fig.4 PPI network constructed with the target genes

3 討論

本研究基于公開數(shù)據(jù)庫的miRNA 表達譜，得到DEMs 的靶基因，篩選ESCC 潛在的新基因和機制。這些基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物學過程有關(guān)，并且在癌癥通路、MAPK通路、調(diào)節(jié)干細胞多能性等信號通路中顯著富集。PPI 網(wǎng)絡顯示了這些靶基因的相互作用關(guān)系，在PPI 網(wǎng)絡中我們鑒定了5 個Hub 基因：SMURF2、BTRC、SMURF1、UBE2D1、CUL2。這些基因均與蛋白質(zhì)的泛素化有關(guān)。

蛋白質(zhì)泛素化是一種主要的翻譯后修飾，控制著廣泛的生物學功能，在生理條件下和疾病中維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。它通過蛋白酶體標記蛋白質(zhì)降解，改變其定位，影響其活性，促進或干擾蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤促進和抑制途徑［10，11］。泛素化主要由3 種酶介導：泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）。據(jù)推測，人類基因組中有630 多個E3，40 多個E2，只有2 個E1。E3 能嚴格控制蛋白的不穩(wěn)定性、定位和功能，從而調(diào)節(jié)大量的生物學過程，這激發(fā)了對這些酶作為癌癥藥物靶點的深入研究［12］。

SMURF1 和SMURF2 是2 個關(guān)系密切的C2-WWHECT結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶，屬于HECT E3型NEDD4亞家族。SMURF 1和SMURF 2最初被鑒定為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor β，TGF-β）信號通路的負調(diào)控因子，負責調(diào)控SMAD蛋白的穩(wěn)定性。TGFβ信號通路抑制腫瘤增殖，其在調(diào)控細胞增殖、凋亡、分化、遷移以及癌癥的發(fā)生和發(fā)展等諸多生物學過程中具有重要作用［13，14］。一系列研究表明SMURF1是一種潛在的腫瘤促進因子。在癌細胞中，p53通過RING finger E3 泛素蛋白連接酶與鼠雙微體基因（murine double minute，MDM2）結(jié)合發(fā)生泛素化并隨后被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，因此，MDM2在不同類型的腫瘤中均過表達，并與p53蛋白水平呈負相關(guān)，導致患者生存率下降和預后不良［15］。基因組雜交分析表明SMURF1是胰腺癌和胃癌的潛在致癌因子。在胃癌和透明細胞腎癌患者中，SMURF1水平與生存率呈負相關(guān)［6］。在胰腺、胃、前列腺和卵巢等多種癌細胞模型中，下調(diào)SMURF1可降低腫瘤的發(fā)生［16］。在食管癌中，激活的SMAD2缺乏與ESCC 患者的腫瘤進展有關(guān)，SMURF2 能夠誘導SMAD2泛素化和降解并抵抗TGF-β誘導的生長抑制作用，以此促進ESCC的腫瘤發(fā)展［17］。SMURF 2在食管癌組織（特別是在食管癌細胞增殖活性較高的腫瘤前部）中表達水平高于正常食管上皮，且與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后不良有關(guān)［17］。

BTRC是f-box和WD40重復蛋白家族的成員，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白降解有關(guān)［18］。越來越多的證據(jù)表明，BTRC通過其f-box結(jié)構(gòu)域與skp1和cullin1相互作用，形成一個SCF復合物，使磷酸化的IκBα （p-IκBα）泛素化，從而觸發(fā)NF-κB向細胞核的易位和靶基因的激活［19］。機制研究表明，跨膜四超家族成員15（tetraspanin 15，TSPAN15）可與BTRC相互作用，提高BTRC對p-IκBα的泛素活性，促進p-IκBα的降解和NF-κ B核轉(zhuǎn)位的激活，從而促進食管鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移［20］。

UBE2D1 是E2 泛素結(jié)合酶的成員，屬于UBE2D家族，在一些癌變過程中發(fā)揮著重要作用。UBE2D1也是一個依賴于p53的重要治療靶點。與SMURF1一樣，外源性UBE2D1 可與MDM2 相互作用，在體外以E2 的形式觸發(fā)p53 的泛素化。此前的研究報道表明，在非小細胞肺癌、骨肉瘤、肝癌及肝癌的癌前病變［21］中，UBE2D1 均上調(diào)。在胃癌中，UBE2D1 的沉默抑制胃癌細胞遷移。在結(jié)直腸癌中，UBE2D1過表 達Aurora 激 酶A 參 與Wnt 和Ras-MAPK 信 號 通 路，UBE2D1 沉默降低SMAD 家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）的泛素化水平，從而在腺瘤向癌的發(fā)展過程中發(fā)揮作用，導致結(jié)直腸癌惡化［22］，但是其在食管癌中的作用機制尚不明確。

CUL2是cullin家族成員。cullin家族蛋白是NEDD8的底物，是cullin-RING連接酶（CRL）的支架成分，它是E3連接酶中最大的家族，可催化約20%的細胞蛋白的泛素化，這些蛋白注定要被蛋白酶體系統(tǒng)降解。幾乎所有的真核生物過程都是由CRL催化的蛋白泛素化調(diào)控的，cullin-RING復合物和幾個調(diào)節(jié)伴侶蛋白之間的相互作用協(xié)調(diào)了一系列生物學過程，包括轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導、細胞分裂和分化，而CRL失調(diào)是許多疾病的基礎，并且至少可以作為癌癥的潛在靶點。CUL2修飾細胞周期進展中的蛋白質(zhì)，在無反應的腺癌和鱗狀細胞癌患者中CUL2表達下調(diào)，CUL2下調(diào)也與患者生存顯著相 關(guān)［23］。BZLF1 （BamHI Z fragment leftward open reading frame 1）蛋白直接作為Elongin B/C-CUL2/5-SOCS-box蛋白（ECS）E3連接酶復合物的接頭組件，針對磷酸化的p53進行降解。

泛素化網(wǎng)絡成分的異常表達和突變與癌癥有關(guān)。癌細胞可能利用這些成分的組合去調(diào)控表達來支持致癌信號通路。泛素化作用的功能和最終效果主要取決于效應底物的性質(zhì)和泛素化介導效應的類型。在我們鑒 定 的5 個Hub 基 因 中，SMURF1和UBE2D1在ESCC 中的作用還未被闡明。隨著泛素化底物和受體檢測技術(shù)的進步，進一步研究在ESCC 中這些基因?qū)Ψ核鼗淖饔茫軌蚋玫亟沂綞SCC 的疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，為抗癌新藥的研究提供新靶點。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

作者聲明無利益沖突。

The authors declare no conflict of interest.

作者貢獻/Authors'Contributions

靳步、于紅、袁穎、陳婉玉參與了實驗設計；靳步、于紅、徐滸東、黃曉蕾、何佳璐參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by JIN Bu， YU Hong， YUAN Ying and CHEN Wanyu. The manuscript was drafted and revised by JIN Bu，YU Hong， XU Hudong， HUANG Xiaolei and HE Jalu. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-09-03

·Accepted：2022-04-06

·Published online：2022-04-28