SMAD2 和SMAD3 在人胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中的不同調(diào)控作用

趙冰楠，馬雙羽，胥春龍，王 瓊

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市“細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)控與疾病”前沿科學(xué)研究基地，上海 200025；2.上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心，上海 200031

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGFβ） 超家族的細(xì)胞因子，包括TGFβ、活化素（activin）、 nodal 生 長(zhǎng) 分 化 因 子（nodal growth differentiation factor，Nodal） 和 骨 形 態(tài) 發(fā) 生 蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）等，參與調(diào)控后生動(dòng)物發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)與再生、免疫監(jiān)測(cè)以及腫瘤發(fā)生等過(guò)程。TGFβ 信號(hào)異常會(huì)導(dǎo)致發(fā)育缺陷、免疫紊亂、纖維化形成和癌癥等疾病的發(fā)生［1］。TGFβ 超家族細(xì)胞因子與TGFβ Ⅱ型受體結(jié)合后，TGFβ Ⅱ型受體將磷酸化TGFβ Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體進(jìn)而招募SMAD 蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein） ——SMAD2 和SMAD3，并磷酸化其C-末端Ser-Ser-X-Ser（SSXS）序列。磷酸化的SMAD2/3 與通用SMAD4 形成復(fù)合物后入核，進(jìn)而與靶基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子上的SMAD結(jié)合元件結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［1］。

TGFβ 家族成員廣泛存在于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）中。ESC 是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESC）存在著由TGFβ/activin 誘導(dǎo)磷酸化的SMAD2/3。通過(guò)SB431542 抑制TGFβ/activin受體活性，SMAD2/3的磷酸化水平下降將促進(jìn)hESC 自發(fā)分化［2-3］。并且，SMAD2/3 還可以與多能性因子NANOG 同源盒（nanog homeobox，NANOG）的啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控NANOG 的表達(dá)［4-5］。這些研究證實(shí)了TGFβ信號(hào)對(duì)于維持hESC多能性的重要作用。在合適的條件下，ESC可以在體外模擬胚胎早期的發(fā)育過(guò)程，包括分化成為3 個(gè)胚層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。在缺乏TGFβ 信號(hào)的情況下，人和小鼠的ESC 均默認(rèn)分化成為外胚層，而中胚層和內(nèi)胚層的分化則需要TGFβ 家族Nodal/activin和BMP 等信號(hào)的誘導(dǎo)激活［6］。例如，Nodal/activin活化的SMAD2/3 可直接與內(nèi)胚層譜系特異性因子性別決定區(qū)Y 框蛋白17（sex determining region Y-box 17，SOX17）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2 （forkhead box A2， FOXA2）、 GATA 結(jié) 合 蛋 白6 （gata binding protein 6， GATA6） 和GSC 同 源 盒（goosecoid homeobox，GSC）等結(jié)合，誘導(dǎo)hESC 向定型內(nèi)胚層（definitive endoderm，DE）分化；SMAD2/3 還可進(jìn)一步與脫中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）相互作用，啟動(dòng)內(nèi)胚層基因網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄［7-8］。因此，ESC向中內(nèi)胚層（mesendoderm，ME）分化的過(guò)程中，TGFβ信號(hào)通路發(fā)揮著極其重要的作用。

SMAD 蛋白是經(jīng)典的TGFβ 信號(hào)下游關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。SMAD2 和SMAD3 的蛋白結(jié)構(gòu)高度相似，但全長(zhǎng)的SMAD2 的MH1 結(jié)構(gòu)域中還存在一個(gè)由3號(hào)外顯子（exon 3，E3）編碼的30 個(gè)氨基酸區(qū)域。當(dāng)這個(gè)外顯子被剪接后，SMAD2 將產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)和功能上類(lèi)似于 SMAD3 的短蛋白質(zhì)產(chǎn)物（SMAD2β）［9］。由于SMAD2 和SMAD3 在結(jié)構(gòu)上較為相似，因此兩者常被視為同等功能的轉(zhuǎn)錄因子。但是，不少研究已經(jīng)表明SMAD2 和SMAD3 的功能其實(shí)并不完全相同。Smad2與Smad3敲除小鼠的表型各異。Smad2-/-小鼠因?yàn)樵c胚發(fā)育障礙而死亡，而Smad3-/-小鼠的胚胎卻基本正常［10-12］。在嵌合體實(shí)驗(yàn)中，SMAD2 缺陷的ESC 不能形成DE［13-14］。此外，SMAD2，而非SMAD3，在TGFβ 信號(hào)作用下可直接活化NANOG 的表達(dá)，因此對(duì)hESC 和小鼠上胚層干細(xì)胞的多能性維持更為重要［15］。沒(méi)有TGFβ信號(hào)刺激時(shí)，SMAD2 和SMAD3 呈現(xiàn)不同的亞細(xì)胞定位——SMAD2 主要分布于細(xì)胞質(zhì)，而SMAD3 則傾向于聚集在細(xì)胞核［9，16］。在小鼠多能性細(xì)胞中，先驅(qū)因子叉頭框轉(zhuǎn)錄因子H1 （forkhead box H1，F(xiàn)OXH1）首先將SMAD3 募集到ME 分化基因的啟動(dòng)子上；而SMAD2 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)等待TGFβ 信號(hào)的來(lái)臨。一旦TGFβ 誘導(dǎo)的分化啟動(dòng)，SMAD2 被磷酸化激活，并與SMAD4 結(jié)合。TGFβ 信號(hào)驅(qū)動(dòng)的SMAD2-SMAD4 復(fù)合物將分化信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，并與FOXH1-SMAD3 共同結(jié)合迅速啟動(dòng)ME 相關(guān)基因的表達(dá)［9］。

雖然，TGFβ 家族在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有非常重要的調(diào)控作用，但在hESC 中，其下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SMAD2 和SMAD3 對(duì)hESC 的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究將通過(guò)比較hESC 中SMAD2 和SMAD3 的表達(dá)，以及SMAD2或SMAD3敲除對(duì)hESC 多能性基因以及分化過(guò)程中神經(jīng)外胚層（neuroectoderm，NE）和ME相關(guān)基因表達(dá)的影響，揭示SMAD2 和SMAD3 在調(diào)控干細(xì)胞功能方面的差異，進(jìn)一步解析TGFβ-SMAD復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，以期揭示早期胚胎發(fā)育過(guò)程中信號(hào)調(diào)控機(jī)制，為探索疾病機(jī)制和治療等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 hESC（H1-icas9）由紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）的HUANGFU實(shí)驗(yàn)室建立［17］并贈(zèng)予。

1.1.2 質(zhì)粒 lentiGuide-Puro（#52963）、psPAX2（#12260） 和pMD2.G （#12259） 質(zhì) 粒 均 購(gòu) 自 美 國(guó)Addgene 公 司； pLVX-Tight-Puro 和pLVX-Tet-On Advanced（#632162）質(zhì)粒均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。

1.1.3 主要試劑 Essential 8 培養(yǎng)基、Essential 6 培養(yǎng)基、Advanced RPMI 培養(yǎng)基、GlutaMAX、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、青霉素/鏈霉素、PowerUp?SYBR?Green 預(yù)混液和Pierce?Coomassie Plus（Bradford）檢測(cè)試劑均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，ROCK 抑制劑Y-27632 2HCl（S1049，美國(guó)Selleck 公司），活化素A（activin A，AC）（12014E，美國(guó)PeproTech 公司），TGFβ 抑制劑SB431542（161410，美國(guó)Tocris 公司），糖原合成酶激酶-3 （glycogen synthase kinase 3，GSK-3） 抑 制 劑CHIR99021 （4423，美 國(guó)Tocris 公司），BMP 抑制劑LDN193189 （1509，美國(guó)Axon Medchem 公司），熒光二抗IRDye 800CW/680RD（美國(guó)LI-COR 公司），SMAD2/3 抗體（8685S）、SMAD2抗體（5339S）、SMAD3 抗體（9523S）、SOX1 抗體（4194）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4） 抗 體 （5279）、 SOX2 抗 體（365823） 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，SOX17 抗體（AF1924）、C-X-C 模 體 趨 化 因 子 受 體4 （C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）抗體（FAB170 A）購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，γ-微管蛋白（γ-tubulin）抗體（T6074，美國(guó)Sigma 公司），配對(duì)盒因子6（paired box 6， PAX6） 抗 體 （901301， 美 國(guó)BioLegend 公司），EOMES 抗體（11-4877-41，美國(guó)eBioscience公司）。

1.2 方法

1.2.1SMAD敲除細(xì)胞系構(gòu)建 利用iCRISPR 方法［17］構(gòu) 建 H1-icas9 的SMAD2敲 除 （SMAD2knockout， SMAD2KO） 和SMAD3敲 除（SMAD3knockout， SMAD3KO） 細(xì) 胞 系。 將SMAD2和SMAD3的 小 型 導(dǎo) 引RNA （small-guiding RNA，sgRNA）克隆入lentiGuide-Puro［18］質(zhì)粒中，sgRNA的靶向序列分別為：SMAD2，ATGTTATATATTGCC GATTA；SMAD3， ACCTGAATGGGCCTTTGCAG。在HEK293T 細(xì)胞中使用Lipofectamine2000 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）包裝慢病毒，收集轉(zhuǎn)染48 h 的慢病毒去感染H1-icas9 細(xì)胞。H1-icas9 細(xì)胞感染了包含sgRNA 的慢病毒后，通過(guò)每日持續(xù)添加強(qiáng)力霉素（doxycycline，dox）2 mg/mL 誘導(dǎo)Cas9 表達(dá)5 d。保持H1-icas9 細(xì)胞以單細(xì)胞密度生長(zhǎng)，以允許克隆細(xì)胞系的擴(kuò)增與分離。克隆的挑選、基因分型和擴(kuò)增按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行［17］。

1.2.2 在SMAD敲除細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)SMAD蛋白建立SMAD2和SMAD3的dox 誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)。pLVX-Tight-Puro 是一種受四環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒表達(dá)載體。pLVX-Tet-On 上具有受dox 調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA。當(dāng)添加dox 誘導(dǎo)rtTA 的表達(dá)后，rtTA 可以激活pLVX-Tight-Puro 上的四環(huán)素操作子，從而誘導(dǎo)操作子下游的蛋白表達(dá)。人源SMAD2和SMAD3的開(kāi)放閱讀框被克隆到pLVX-Tight-Puro 載體中。替換pLVX-Tet-On 中的CMV 啟動(dòng)子為pGK 啟動(dòng)子，防止其 在ESC 中 沉 默［19］。在HEK293T 細(xì) 胞 中，利 用Lipofectamine2000 將病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G）、包 含 人 源SMAD2或SMAD3的pLVXTight-Puro 表達(dá)質(zhì)粒以及pLVX-Tet-On 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入HEK293T 細(xì) 胞 中， 隨 后 收 集 慢 病 毒， 感 染SMAD2KO 或SMAD3KO 細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)外源性SMAD蛋白的過(guò)表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)以及誘導(dǎo)hESC 向DE 和NE 分化

hESC 貼壁培養(yǎng)在Essential 8 培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后使用EDTA 按照一定比例傳代，細(xì)胞培養(yǎng)皿用基底膠（Matrigel）包被。

（1）誘導(dǎo)hESC 向DE 分化 D0（代表多能性階段）：用含Rock 抑制劑的Essential 8 培養(yǎng)基將hESC按照1×105個(gè)/孔鋪于6 孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。D1（代表ME 階段）：更換包含AC 和GSK-3抑制劑CHIR99021（CHIR）的Advanced RPMI內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基Ⅰ，培養(yǎng)1 d。D3 （代表DE 階段）：更換添加AC 的Advanced RPMI 內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基Ⅱ［20-21］，每日更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d。收集D3細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)和免疫熒光染色，鑒定SOX17、EOMES、CXCR4和SMAD2的表達(dá)。

（2）誘導(dǎo)hESC 向NE 分化 D0（代表多能性階段）：利用含Rock抑制劑的Essential 8培養(yǎng)基將hESC按照5×105個(gè)/孔鋪于6 孔板中，培養(yǎng)24 h。D1～D8（代表NE 階段）：更換添加TGFβ 抑制劑SB431542 和BMP 抑制劑LDN193189 的Essential 6 培養(yǎng)基，每日更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 d。收集D8細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)和免疫熒光染色，鑒定PAX6、OCT4 和SOX1的表達(dá)。

1.2.4 RNA 的提取以及實(shí)時(shí)定量PCR 收取ME 分化過(guò)程中的D0 和D1 細(xì)胞，檢測(cè)EOMES、FOXA2和GSC的RNA 表達(dá)水平。利用500 μL Trizol 裂解細(xì)胞，隨后加入200 μL三氯甲烷，上下劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min 后，4°C 12 000×g離心15 min。離心后，轉(zhuǎn)移上層液體于新的1.5 mL EP 管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置15 min，4 ℃12 000×g離心15 min，可在EP 管底部觀察到白色RNA 沉淀。去除上清液，用75%乙醇（DEPC 水配制）和無(wú)水乙醇分別洗滌1 次，晾干沉淀后加入DEPC 水 溶 解， 定 量。 用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （AT341，北京全式金生物）試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后在384孔板中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR （real-time quantitative reverse transcription PCR， qRT-PCR）， 每 孔 加 入5 μL PowerUp?SYBR?Green預(yù)混液、1 μL 1 μmol/L 上游引物和下游引物、2.5 μL cDNA（1∶10 稀釋?zhuān)┖?.5 μL ddH2O，在熒光定量PCR 儀（CFX384 Touch，美國(guó)Bio-Rad 公司）上檢測(cè)。反應(yīng)條件為Bio-Rad 熒光定量PCR 儀的PrimePCR 程序。qRT-PCR 所用引物的序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 向預(yù)先貼壁培養(yǎng)的hESC 中加入適量非動(dòng)物源性重組酶TrypLE，消化細(xì)胞，使用含有血清的培養(yǎng)基重懸中和細(xì)胞，160×g離心5 min，用預(yù)冷PBS 清洗3 次。使用流式緩沖液稀釋抗體和活細(xì)胞染料，重懸清洗后的細(xì)胞團(tuán)塊，利用抗體進(jìn)行標(biāo)記，避光4 ℃染色30 min 至1 h，隨后通過(guò)流式細(xì)胞儀（MoFlo Astrios EQ， 美國(guó)Beckman Coulter 公司）檢測(cè)不同抗體標(biāo)記的蛋白熒光表達(dá)情況。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 分別收取適量未處理hESC（0 h），AC 和GSK-3 抑制劑CHIR 處理12、24、36、48 h 的hESC，SMAD2KO、SMAD3KO 細(xì)胞或者在SMADKO 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)外源性SMAD 蛋白的細(xì)胞樣品，利用RIPA 蛋白裂解液［20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L EDTA、1% 甘油、150 mmol/L NaCl、1% NP40、1% 脫氧膽酸鈉］裂解細(xì)胞制備蛋白樣品，通過(guò)Pierce?Coomassie Plus（Bradford）檢測(cè)試劑進(jìn)行蛋白定量后取適量蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE，采用濕式轉(zhuǎn)膜法，5% BSA 溶液室溫?fù)u床封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。1×TBST 洗3次，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，1×TBST 洗3次后顯影成像，通過(guò)雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLx，美國(guó)LI-COR 公司）分析蛋白熒光強(qiáng)度。

1.2.7 免疫熒光染色 培養(yǎng)hESC 至合適密度，1×PBS 洗滌1 次后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，1%Triton X-100 通透2 min，5% BSA 溶液室溫封閉1 h，加入一抗4°C孵育過(guò)夜。1×TBST洗3次，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，1×TBST 洗3 次，加入熒光染料DAPI 復(fù)染標(biāo)記細(xì)胞核，室溫避光孵育15 min，1×TBST 洗3 次，使用熒光顯微鏡（ECLIPSE Ts2R，日本Nikon公司）采集圖像。

1.2.8 iTranscriptome數(shù)據(jù)庫(kù)分析 根據(jù)iTranscriptome［22］數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.itranscriptome.org/），對(duì)小鼠原腸胚運(yùn)動(dòng)E6.5～E7.5時(shí)期SMAD2和SMAD3的RNA表達(dá)進(jìn)行分析并得到它們的表達(dá)分布模式圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)GraphPad Prism Version 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次以上獨(dú)立重復(fù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示。組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMAD2和SMAD3在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

SMAD2 和SMAD3 的蛋白序列高度相似，尤其是兩者的MH1 結(jié)構(gòu)域的序列具有>90%的一致性。但是，SMAD2 包含了2 段插入序列：一段是連接2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的環(huán)延伸序列；另一段是靠近β 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的高度保守的E3 插入序列（圖1A）。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，SMAD2 和SMAD3 具有不同的表達(dá)模式和豐度。iTranscriptome 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，小鼠原腸胚運(yùn)動(dòng)E6.5～E7.5 時(shí)期，Smad2的RNA 表達(dá)幾乎遍布整個(gè)上胚層，相比之下，Smad3的RNA 表達(dá)水平不高且分布相對(duì)較局限（圖1B）。hESC 需要TGFβ 信號(hào)來(lái)進(jìn)行自我更新和分化。那么SMAD2 和SMAD3 的蛋白水平是否會(huì)在干細(xì)胞的不同階段也呈現(xiàn)出表達(dá)上的差異？hESC 在AC 和GSK-3 抑制劑CHIR 的處理下向ME 分化。蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）結(jié)果顯示，SMAD2 在hESC 中的表達(dá)水平更高（圖1C）。利用Odyssey 成像系統(tǒng)軟件分析Western blotting 實(shí)驗(yàn)的熒光強(qiáng)度顯示，在hESC 分化的前36 h，SMAD2 和SMAD3 的表達(dá)量比值可以達(dá)到3.5∶1～4.5∶1；當(dāng)分化誘導(dǎo)達(dá)到48 h，SMAD3 的蛋白表達(dá)有所上調(diào)，SMAD2 和SMAD3 的表達(dá)量比值 接 近 于1.5∶1 （圖1D）。因 此，SMAD2 和SMAD3 在hESC 中的表達(dá)比例與其在小鼠原腸胚運(yùn)動(dòng)時(shí)期的表達(dá)比例較為相似——SMAD2 是最主要表達(dá)的調(diào)控因子。

圖1 SMAD2和SMAD3的表達(dá)模式Fig 1 Expression pattern of SMAD2 and SMAD3

2.2 單一敲除SMAD2 或者SMAD3 對(duì)hESC 多能性因子表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究SMAD2 和SMAD3 在hESC 中的功能，利用CRISPR/sgRNA 技術(shù)構(gòu)建了SMAD2 KO 和SMAD3KO 細(xì)胞系。與野生型hESC 基因序列相比，SMAD2KO 細(xì)胞的4 號(hào)外顯子丟失了7 bp 堿基，而SMAD3KO 細(xì)胞的9 號(hào)外顯子丟失了101 bp堿基（圖2A）。Western blotting 結(jié)果顯示SMAD2 或SMAD3 蛋白分別在SMAD2KO 和SMAD3KO 細(xì)胞中被特異性敲除（圖2B）。為了鑒定SMAD2敲除和SMAD3敲除對(duì)hESC 多能性的影響，對(duì)多能性因子OCT4 和SOX2 進(jìn)行了免疫熒光染色。結(jié)果顯示，SMAD2或SMAD3的敲除沒(méi)有影響OCT4 和SOX2 的表達(dá)。這說(shuō)明單一敲除SMAD2或SMAD3并不會(huì)影響hESC 多能性因子的表達(dá)（圖2C）。但是，值得注意的是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)法在hESC 中獲得SMAD2和SMAD3的雙敲除克隆（數(shù)據(jù)未顯示）。推測(cè)這是因?yàn)橥瑫r(shí)敲除SMAD2和SMAD3將導(dǎo)致hESC 死亡。這說(shuō)明TGFβ 至少需要通過(guò)一個(gè)SMAD2 或者SMAD3 轉(zhuǎn)錄因子來(lái)有效地維持hESC的多能性。

圖2 單一敲除SMAD2或者SMAD3對(duì)hESC多能性因子表達(dá)的影響Fig 2 Influence of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the expression of pluripotent factors in hESCs

2.3 SMAD2 敲除和SMAD3 敲除對(duì)hESC 向NE 分化的影響

既然SMAD2敲除和SMAD3敲除不會(huì)影響hESC的多能性，那么接下來(lái)將檢測(cè)二者對(duì)于hESC 分化能力的影響。首先探究SMAD2 和SMAD3 是否在hESC向NE 分化的過(guò)程中扮演重要角色。通過(guò)從D1～D8 添加TGFβ 抑制劑SB431542 和BMP 抑制劑LDN193189可以誘導(dǎo)hESC向NE分化。第8日，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在野生型hESC、SMAD2KO和SMAD3KO細(xì)胞中，由PAX6 標(biāo)記的NE 細(xì)胞群分布并無(wú)明顯差異（圖3A）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與野生型hESC 相比，無(wú)論是SMAD2KO 還是SMAD3KO 細(xì)胞，多能性因子OCT4 的表達(dá)不變或者稍有下降，但是NE標(biāo)志因子PAX6和SOX1的表達(dá)呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)（圖3B）。這意味著SMAD2或SMAD3的敲除并不會(huì)影響hESC 向NE 的分化。相反，SMAD2KO細(xì)胞甚至呈現(xiàn)出比野生型hESC 更高的PAX6和SOX1的表達(dá)，表明SMAD2 缺失在某種程度上還促進(jìn)了hESC向NE的分化。

圖3 SMAD2敲除和SMAD3敲除對(duì)hESC向NE分化的影響Fig 3 Effect of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the NE differentiation of hESC

2.4 SMAD2 敲除和SMAD3 敲除對(duì)hESC 向DE 分化的影響

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)SMAD2敲除和SMAD3敲除不影響hESC 向NE 分化，甚至SMAD2敲除還能促進(jìn)部分NE 標(biāo)志因子的表達(dá)。接下來(lái)，需要確定這是否與ME 分化受阻所導(dǎo)致的繼發(fā)性NE分化增強(qiáng)有關(guān)。野生型hESC、SMAD2KO 和SMAD3KO 細(xì)胞分別受到GSK-3 抑制劑CHIR 和AC 處理1 d 后（D1）到達(dá)ME 階段，繼續(xù)添加AC 2 d使細(xì)胞分化到達(dá)DE階段。收取D3 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，野生型hESC 和SMAD3KO 細(xì)胞能有效表達(dá)DE 標(biāo)志因子SOX17、CXCR4和EOMES，而SMAD2KO 細(xì)胞中幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SOX17 和EOMES 雙 陽(yáng) 性 或 者SOX17 和CXCR4 雙陽(yáng)性的細(xì)胞（圖4A）。同時(shí)，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SOX17 和SMAD2 在SMAD2KO 細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，而在SMAD3KO 細(xì)胞與野生型hESC 中均有表達(dá)（圖4B）。這一結(jié)果說(shuō)明，SMAD2，而非SMAD3，在hESC 向DE 的分化過(guò)程中參與調(diào)控DE 相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，也說(shuō)明SMAD2KO 細(xì)胞向DE 分化受阻，因此才會(huì)出現(xiàn)部分代償性的NE分化。

圖4 SMAD2敲除和SMAD3敲除對(duì)hESC向DE分化的影響Fig 4 Effect of SMAD2 knockout or SMAD3 knockout on the DE differentiation of hESC

2.5 過(guò)表達(dá)外源性SMAD2 對(duì)SMAD2KO 細(xì)胞向ME分化的影響

上述分析結(jié)果已表明SMAD2敲除會(huì)影響DE標(biāo)志因子的表達(dá)。接下來(lái)，需要驗(yàn)證SMAD2KO 細(xì)胞是否早在ME 階段就出現(xiàn)了分化異常。分別收集野生型hESC以及2種SMAD缺失細(xì)胞在GSK-3抑制劑CHIR和AC處理前（D0）和處理1 d后（D1）到達(dá)ME階段的RNA，并通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)ME的標(biāo)志基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與野生型hESC相比，SMAD2KO細(xì)胞中ME的標(biāo)志基因EOMES、FOXA2和GSC的表達(dá)顯著下降，證實(shí)SMAD2KO 細(xì)胞幾乎無(wú)法誘導(dǎo)ME 基因的表達(dá)；同時(shí)，SMAD3敲除對(duì)ME分化基因表達(dá)的影響甚微（圖5A）。那么SMAD2KO 細(xì)胞向ME 分化障礙，是否是由特異性缺失SMAD2導(dǎo)致的呢？利用Teton藥物誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在SMAD2KO和SMAD3KO細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)外源性的人源SMAD2和SMAD3，進(jìn)而檢測(cè)其向ME分化的能力。Western blotting結(jié)果顯示，在SMAD2KO和SMAD3KO細(xì)胞中分別成功地誘導(dǎo)了SMAD2 和SMAD3 的表達(dá)（圖5B）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，外源性SMAD2 可以幾乎完全恢復(fù)EOMES、FOXA2以及GSC在SMAD2KO細(xì)胞中的表達(dá)；而在外源性SMAD3過(guò)表達(dá)前后，SMAD3KO細(xì)胞ME基因的表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5C）。這些結(jié)果均說(shuō)明，SMAD2和SMAD3對(duì)hESC向ME的分化調(diào)控存在差異；SMAD2 在hESC 向ME 分化的過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色。

圖5 過(guò)表達(dá)外源性SMAD2對(duì)SMAD2KO細(xì)胞向ME分化的影響Fig 5 Effect of overexpressing exogenous SMAD2 in SMAD2KO cells on the ME differentiation

3 討論

TGFβ 家族的細(xì)胞因子及其下游的SMAD 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是多細(xì)胞動(dòng)物發(fā)育和組織再生的控制核心。許多遺傳性和細(xì)胞性疾病都是由TGFβ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂所造成。SMAD2和SMAD3是TGFβ信號(hào)下游公認(rèn)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，與SMAD4 形成異源三聚體后入核調(diào)控下游基因的表達(dá)。除了SMAD2的MH1結(jié)構(gòu)域包含一段E3 插入序列外，SMAD2 和SMAD3 的蛋白結(jié)構(gòu)高度相似，但在調(diào)控干細(xì)胞分化、上胚層發(fā)育以及在病理情況下所介導(dǎo)的TGFβ 作用依然存在差異，而其中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚［16，23］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SMAD2 和SMAD3 在hESC 的多能性階段及分化的過(guò)程中，兩者的表達(dá)水平均存在差異。敲除SAMD2或SMAD3不會(huì)影響多能性因子OCT4 和SOX2 的表達(dá)，也不會(huì)干擾hESC 向NE 的分化。有趣的是，SMAD2敲除足以阻斷hESC 向ME 以及后續(xù)的DE 的分化，并引起部分SMAD2KO 細(xì)胞代償性地向外胚層分化；而SMAD3敲除不會(huì)影響該分化過(guò)程。由此可見(jiàn)，SMAD2對(duì)于hESC向ME分化更為關(guān)鍵。

SMAD2和SMAD3對(duì)于ESC的干性維持和ME分化具有不同的調(diào)控作用。在一些情況下，SMAD2 與SMAD3 的功能有冗余現(xiàn)象，但是不少研究表明SMAD2 往往比SMAD3 具有更廣泛的作用。例如，Th17 輔助性T 細(xì)胞的分化需要SMAD2 而不是SMAD3［24］。SMAD2或SMAD3缺失小鼠具有截然不同的表型。如果將SMAD3 重構(gòu)到內(nèi)源性SMAD2 位點(diǎn)，可以部分挽救SMAD2 缺失導(dǎo)致的小鼠胚胎致死［25］。此外，SMAD2 特有的高度保守的E3 插入序列可能是導(dǎo)致SMAD2 和SMAD3 功能差異的關(guān)鍵。在沒(méi)有TGFβ 信號(hào)刺激的情況下，E3 序列能決定SMAD2 和SMAD3 在細(xì)胞內(nèi)的定位：敲除SMAD2 中的E3 序列，會(huì)使SMAD2 像SMAD3 一樣累積在細(xì)胞核中；反之，若將E3 序列插入到SMAD3 的MH1 結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位點(diǎn)，會(huì)使SMAD3 在細(xì)胞質(zhì)中富集［15］。在小鼠ESC 中，從內(nèi)源性的SMAD2 中移除E3 序列（S2ΔE3），可以有效地干擾類(lèi)胚體對(duì)于外源性AC 的快速應(yīng)答。并且，這類(lèi)S2ΔE3 細(xì)胞注入小鼠囊胚中所形成的嵌合體具有明顯的胚外中胚層異常，但是對(duì)胚胎本身的影響并不大［9］。

值得注意的是，與我們前期在小鼠ESC中的研究相比［9］，SMAD2的E3序列對(duì)于hESC的調(diào)控作用并不明顯。敲除SMAD2 特有的E3 插入序列對(duì)于hESC 向ME分化的影響非常短暫和有限（數(shù)據(jù)未顯示）。這些表型的差異可能與TGFβ在2種ESC中的作用狀態(tài)不同有關(guān)。始發(fā)態(tài)hESC 中，TGFβ 信號(hào)已經(jīng)被激活，SMAD2/3預(yù)結(jié)合在關(guān)鍵ME基因的啟動(dòng)子上［26］。而在原始態(tài)小鼠ESC中，SMAD3和先驅(qū)因子FOXH1預(yù)結(jié)合在ME 基因的啟動(dòng)子上，而SMAD2 則依賴(lài)于E3 序列積聚在細(xì)胞質(zhì)中［9］。當(dāng)TGFβ 信號(hào)啟動(dòng)分化時(shí)，SMAD2-SMAD4復(fù)合物迅速入核，與SMAD3-FOXH1匯合并激活ME基因的轉(zhuǎn)錄。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了SMAD2的E3插入序列作用的精確性和時(shí)效性［9］。

綜上所述，SMAD2 和SMAD3 在結(jié)構(gòu)上高度相似，但主要是SMAD2，而非SMAD3，決定了hESC在TGFβ 信號(hào)的誘導(dǎo)下向ME 分化。這種功能上的差異可能并不是完全由SMAD2特有的E3插入序列所導(dǎo)致，其背后的分子作用機(jī)制仍需要更深一步的探索。闡明TGFβ信號(hào)通路中SMAD2和SMAD3差異性調(diào)控ESC 分化的原因，將有助于理解TGFβ 信號(hào)通路的機(jī)制與功能，進(jìn)而為胚胎發(fā)育生物學(xué)、干細(xì)胞研究和疾病治療提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和新的思考方向。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

趙冰楠主要完成細(xì)胞培養(yǎng)與分子實(shí)驗(yàn)的工作，馬雙羽主要完成流式分析與免疫熒光染色的工作，胥春龍主要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)與數(shù)據(jù)分析整理，王瓊主要負(fù)責(zé)論文整體構(gòu)思與文章撰寫(xiě)。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

ZHAO Bingnan performed the cell culture and molecular experiments.MA Shuangyu conducted the flow cytometry analysis and immunofluorescence staining experiments. XU Chunlong guided this project and conducted data analysis. WANG Qiong designed and supervised the project and wrote the manuscript. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-19

·Accepted：2022-04-10

·Published online：2022-04-28