核小體重塑及組蛋白去乙?；笍?fù)合物的負(fù)染電鏡結(jié)構(gòu)分析

段昱娟，黃 晶

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，上海 200125

組蛋白修飾是生物體表觀遺傳調(diào)控的一種主要方式，多種不同類型組蛋白修飾酶通過在染色質(zhì)核小體的核心組蛋白上添加或去除甲基、乙酰基、磷酸基或泛素等共價(jià)修飾，動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，從而廣泛參與到基因表達(dá)調(diào)控、干細(xì)胞多能性維持、DNA 損傷修復(fù)及個(gè)體發(fā)育等重要的生命活動(dòng)過程［1］。組蛋白上的乙?；瘎?dòng)態(tài)修飾由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC） 共 同 調(diào) 控［2］。HDAC 通過去除HAT 向組蛋白尾部加入的乙酰基修飾，使染色質(zhì)形成更高級(jí)、濃縮的結(jié)構(gòu)，從而有效抑制基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白上乙?；揎椘胶獾奈蓙y往往會(huì)使基因表達(dá)失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC 抑制劑能通過增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭?，提高p21等基因的表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化或凋亡［4］，現(xiàn)已成為腫瘤靶向治療的一個(gè)新熱點(diǎn)。目前已經(jīng)研發(fā)出的多種能夠有效抑制HDAC 酶活性的抑制劑大多為針對(duì)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類HDAC的廣譜抑制劑，在臨床治療中具有較強(qiáng)的不良反應(yīng)。另外，在通常情況下，HDAC會(huì)被招募到Sin3復(fù)合物、核小體重塑和組蛋白去乙?；笍?fù)合物（nucleosome remodeling and deacetylase complex，NuRD 復(fù) 合 物）、 CoREST （corepressor of RE1-silencing transcription factor）復(fù)合物等不同的大分子復(fù)合物中［5-8］，與其他亞基協(xié)同作用，發(fā)揮功能活性。HDAC抑制劑對(duì)不同的HDAC復(fù)合物也表現(xiàn)出明顯的選擇偏向性［9］。單純靶向于HDAC蛋白自身的癌癥治療藥物具有較大的局限性，設(shè)計(jì)更為有效的、靶向于特定復(fù)合物的藥物是目前藥物開發(fā)新的突破點(diǎn)，也是研究者面臨的巨大挑戰(zhàn)。

NuRD 復(fù)合物是一種同時(shí)具備染色質(zhì)重塑酶和去乙?；富钚缘拇蠓肿訌?fù)合物，由ATP 依賴的染色質(zhì)重塑因子CHD3/4（chromodomain helicase DNA binding protein 3/4）、轉(zhuǎn)錄抑制因子GATAD2A/B（GATA zinc finger domain containing 2A/B）、甲基化CpG 結(jié)合蛋白MBD2/3（methyl-CpG-binding domain protein 2/3）、組蛋白去乙?；窰DAC1/2（histone deacetylase 1/2）、 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MTA1/2/3（metastasis-associated protein 1/2/3）和組蛋白結(jié)合蛋白R(shí)BBP4/7 （retinoblastoma-binding protein 4/7） 等多種蛋白質(zhì)亞基組成［10］。基于NuRD 復(fù)合物在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復(fù)及干細(xì)胞多能性維持上的重要作用，其對(duì)于機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，其水平也與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)［11-14］。受限于超大復(fù)合物表達(dá)純化的難度，目前已有的NuRD 復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究多聚焦于去乙酰化核心模塊MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7，完整復(fù)合物的 研 究 是較為缺失的。MILLARD 等［15-17］自2013 年以來，通過結(jié)構(gòu)解析初步揭示了NuRD 復(fù)合物去乙酰化核心模塊中MTA1/2/3 作為支架蛋白分別招募HDAC1/2和RBBP4/7 的分子機(jī)制。LOW 等［18］通過金標(biāo)準(zhǔn)絕對(duì)定量的質(zhì)譜分析，初步推斷NuRD 復(fù)合物 中 各 亞 基 RBBP4/7、 HDAC1/2、 MTA1/2/3、MBD2/3、GATAD2A/B、CHD3/4 的化學(xué)計(jì)量比為4∶2∶2∶1∶1∶1，并通過交聯(lián)質(zhì)譜、靜態(tài)光散射等多種方法證實(shí)了NuRD 復(fù)合物是由MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7 去乙酰化核心模塊和MBD2/3-GATAD2A/B-CHD3/4 染色質(zhì)重塑模塊兩部分組成，且整體的NuRD 復(fù)合物可能呈現(xiàn)為非對(duì)稱的、模塊化的狀態(tài)。

解析獲得完整NuRD 復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)信息，了解各亞基間的相互作用關(guān)系，獲得更多的位點(diǎn)信息，對(duì)于探索NuRD 復(fù)合物參與基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制以及設(shè)計(jì)相應(yīng)的靶向藥物具有重要意義。本研究擬通過哺乳細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)和蛋白純化系統(tǒng)，富集得到完整的人源NuRD 復(fù)合物，借助120 kV 透射電鏡和單顆粒重構(gòu)技術(shù)獲得NuRD 復(fù)合物的負(fù)染三維結(jié)構(gòu)模型，以期為后續(xù)解析高分辨率NuRD 復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑與儀器 Fast Pfu DNA 聚合酶（全式金）， 限制性核酸內(nèi)切酶（Thermo Fisher Scientific），DNA 連接酶Ligation high（Toyobo），質(zhì)粒大量抽提試劑盒（康為世紀(jì)），聚乙烯亞胺（polyethylenimine， PEI） 40 000 （Polysciences），Balance CD 293 培養(yǎng)基（Cell wise），Ni-NTA 瓊脂糖（Qiagen），抗DYKDDDDK G1 親和樹脂（金斯瑞），兔源HDAC1 單克隆抗體（Proteintech），兔源MTA1單克隆抗體、兔源RBBP4 多克隆抗體、兔源CHD4單克隆抗體（ABclonal），鼠源抗His單克隆抗體、鼠源抗Flag 單克隆抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗兔IgG（AbHO），ECLTMPrime Western blotting 檢 測(cè) 試 劑（Cytiva），Superose 6 Increase 5/150、快速蛋白液相色譜儀（GE healthcare），eBlot L1 快速濕轉(zhuǎn)儀（金斯瑞），高分辨軌道阱質(zhì)譜儀（型號(hào)Q-Exactive HF，Thermo Fisher Scientific），碳膜銅網(wǎng)（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司），透射電鏡（型號(hào)Talos L120C，F(xiàn)EI），3%乙酸雙氧鈾（uranyl acetate，UA）（河南銳欣實(shí)驗(yàn)用品有限公司）。

1.1.2 細(xì)胞、菌株與載體 人胚腎來源的Expi293F細(xì)胞，大腸埃希菌DH5α菌種、Stbl3菌種，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pMLink均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成和DNA 序列測(cè)定 實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。DNA序列測(cè)定由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PCR 從HEK293T 細(xì)胞cDNA 文庫中獲得人源MBD3 全長(zhǎng)（氨基酸殘基：1～291）、GATAD2A全長(zhǎng)（氨基酸殘基：1～633）的基因編碼序列，分別插入到帶有Flag 或His 純化標(biāo)簽的pMLink 載體中，獲得相應(yīng)的pMLink-MBD3-3×Flag、pMLink-10×His-GATAD2A重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)蛋白 將重組質(zhì)粒pMLink-MBD3-3×Flag 和pMLink-10×His-GATAD2A 以1∶1的比例加入到20 mL 哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中，室溫孵育10 min。另外將轉(zhuǎn)染試劑PEI 加入到20 mL 哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中室溫孵育10 min。將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液與質(zhì)粒稀釋液混合，繼續(xù)室溫孵育20 min，最后將轉(zhuǎn)染混合物加入到密度為2.5×106個(gè)/mL 的Expi293F 細(xì)胞中（每毫升細(xì)胞轉(zhuǎn)染1 mg 目的基因質(zhì)粒，使用2 mL 1 mg/mL pH 7.0 的PEI 轉(zhuǎn)染試劑）。加入轉(zhuǎn)染體系后將細(xì)胞在37℃、5% CO2的 搖 床 中125 r/min 繼 續(xù) 培 養(yǎng)，48～52 h 后 收集細(xì)胞用于蛋白純化。

1.2.4 NuRD 復(fù)合物純化 將轉(zhuǎn)染表達(dá)有目的蛋白復(fù)合物的Expi293F細(xì)胞用裂解緩沖液（含50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、10%甘油、20 mmol/L咪唑、1 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF、5 mmol/L benzamidine、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽、1μg/mL胃蛋白酶抑制劑）重懸，冰浴條件下超聲破碎。將勻漿于4 ℃、46 000×g高速離心1 h，離心后的上清液與平衡好的Ni-NTA填料于旋轉(zhuǎn)混合儀上4 ℃緩慢混合1 h?；旌贤瓿珊髮⒒旌弦?35×g離心5 min，棄去上清液，將填料轉(zhuǎn)移至層析管中進(jìn)行重力流動(dòng)的親和層析實(shí)驗(yàn)，用裂解緩沖液清洗填料，直至考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)液檢測(cè)不到蛋白組分流出后，再用相應(yīng)的洗脫緩沖液Ⅰ（含25 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、250 mmol/L 咪唑、1 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF、5 mmol/L benzamidine、1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、1μg/mL胃蛋白酶抑制劑）洗脫蛋白。將洗脫下來蛋白與抗DYKDDDDK G1 親和樹脂低溫旋轉(zhuǎn)混合約5 h，之后用洗滌緩沖液（含25 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪 唑、1 mmol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L PMSF、5 mmol/L benzamidine、1 μg/mL亮抑蛋白酶肽、1μg/mL胃蛋白酶抑制劑）清洗填料直至無雜蛋白流出，再用洗脫緩沖液Ⅱ（含25 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、 150 mmol/L NaCl、500 μg/mL Flag 多肽）洗脫目的蛋白。將蛋白樣品用截留分子量為30 000 的濃縮管濃縮至約100 μL，利用分子篩Superose 6 Increase 5/150 進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。最后通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分析鑒定，合并組分完整的NuRD 復(fù)合物蛋白溶液。

1.2.5 NuRD 復(fù)合物組分的鑒定

（1）利用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）鑒定NuRD 復(fù)合物中的各蛋白組分。通過SDS-PAGE分離蛋白樣品后，用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后將PVDF 膜浸潤(rùn)在含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h。倒棄封閉液，分別加入稀釋至合適濃度的HDAC1、MTA1、RBBP4、CHD4 蛋白特異性抗體及抗His、Flag 標(biāo)簽特異性抗體，4 ℃孵育過夜。用膜清洗液TBST （含20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.05% tween-20）清洗PVDF 膜，重復(fù)3 次，每次10 min。之后加入稀釋后的偶聯(lián)了辣根過氧化物酶（HRP）的山羊抗鼠抗體或山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h。用TBST 清洗3 次，每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光成像法顯色鑒定。

（2）通過質(zhì)譜鑒定檢測(cè)純化產(chǎn)物中的蛋白組分。取約20 μg 蛋白，經(jīng)烷基化處理后，加入胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜；酶解肽段經(jīng)C18 柱除鹽后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進(jìn)行分析；質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)提交到Proteome Discoverer 2.3 軟件中，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫中的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）進(jìn)行檢索。

1.2.6 負(fù)染樣品的制備、數(shù)據(jù)收集及模型構(gòu)建 因UA 溶液滲透力較強(qiáng)、顆粒細(xì)膩，故選擇其作為樣品的負(fù)染色液。負(fù)染電鏡實(shí)驗(yàn)步驟如下：使用輝光放電儀對(duì)碳膜銅網(wǎng)進(jìn)行親水化處理后，于碳膜銅網(wǎng)中央滴加3 μL 濃度約為0.05 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液，靜置1 min；用濾紙從碳膜銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的溶液，滴加3 μL 1.5% UA 溶液，染色1 min；用濾紙吸去多余液體，置于數(shù)顯式紅外烘烤燈下烘烤；之后將樣品置于120 kV 透射電鏡中觀察，放大倍數(shù)設(shè)置為57 000 倍，欠焦值設(shè)置為-1.0～-2.5 μm；選擇樣品顆粒分散性和均一性較好的區(qū)域進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。 隨后利用數(shù)據(jù)處理軟件EMAN2 和RELION3.1.1 對(duì)所收集的圖像進(jìn)行處理并生成相應(yīng)的三維模型［19-20］。用傅里葉空間中不同分辨率殼層中2 個(gè)獨(dú)立的計(jì)算結(jié)構(gòu)的相關(guān)性估計(jì)三維結(jié)構(gòu)的分辨率，通常將獲得的結(jié)構(gòu)的空間分辨率定義為傅里葉殼層關(guān)聯(lián)函數(shù)（Fourier shell correlation，F(xiàn)SC）=0.143 時(shí)的空間頻率的倒數(shù)。

1.2.7 NuRD 復(fù)合物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 將PDB 中已提交的亞復(fù)合物MTA1-HDAC1-MBD2 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（PDB：7AO9） 及 亞 基RBBP4 晶 體 結(jié) 構(gòu)（PDB：5FXY）通過UCSF Chimera軟件自動(dòng)匹配至本研究獲得的三維結(jié)構(gòu)模型中［21］，定位二聚體MTA1-HDAC1、RBBP4 及MBD2 在NuRD 復(fù)合物負(fù)染結(jié)構(gòu)模型中的位置，并預(yù)測(cè)其他亞基的定位。

2 結(jié)果

2.1 NuRD復(fù)合物的表達(dá)與純化

經(jīng)過多重篩選最終決定構(gòu)建C端帶有3×Flag標(biāo)簽的MBD3重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒和N端帶有10×His標(biāo)簽的GATAD2A重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒，用于后續(xù)的表達(dá)純化。將構(gòu)建好的質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞Expi293F中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染共表達(dá)，依次通過Ni-NTA純化和Flag標(biāo)簽純化，將純化得到的蛋白通過SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的MBD3和GATAD2A 能成功共純化出細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)內(nèi)源蛋白，在與NuRD復(fù)合物各組分蛋白（圖1A）的分子量進(jìn)行比對(duì)分析后，初步認(rèn)為純化產(chǎn)物為組分齊全、純度較高的NuRD復(fù)合物樣品（圖1B）。為了確認(rèn)復(fù)合物的狀態(tài)以及提高樣品的均一性，將親和層析得到的蛋白樣品通過分子篩Superose 6 Increase 5/150 進(jìn)一步分離純化，得到的復(fù)合物在1.3～1.6 mL 的體積處出峰（圖1C）；該出峰位置對(duì)應(yīng)分子量大于669 000的球狀蛋白物，這與NuRD 復(fù)合物的預(yù)測(cè)大?。ǚ肿恿?20 000）接近。分管收集流出組分，通過SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，結(jié)果顯示復(fù)合物中多組分蛋白比例適當(dāng)，且于1.3～1.6 mL 處共同出峰（圖1D），合并收集可能為NuRD 復(fù)合物的1.3～1.6 mL 流出組分，濃縮用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過整個(gè)分離純化步驟，從2 L 的Expi293F細(xì)胞中可純化出約0.1 mg NuRD復(fù)合物。

圖1 NuRD復(fù)合物的表達(dá)與純化Fig 1 Expression and purification of the NuRD complex

2.2 NuRD 復(fù)合物的組分鑒定

針對(duì)通過兩步親和層析及分子篩純化得到的復(fù)合物，利用蛋白特異性抗體成功檢測(cè)到MTA1、HDAC1、RBBP4 和CHD4 蛋 白（圖2A）。采 用Western blotting 對(duì)檢測(cè)到的各組分蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析，其中，MTA1 和RBBP4 條帶清晰，特異性強(qiáng)（圖2B、2D）；HDAC1 的主條帶清晰，但利用該兔源HDAC1 蛋白單克隆抗體能在約50 000 處同時(shí)檢測(cè)到一條非特異性結(jié)合條帶（圖2C），與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［22］；CHD4 對(duì)應(yīng)條帶信號(hào)強(qiáng)，檢測(cè)到的多條分子量較小的條帶可能為CHD4 降解產(chǎn)物或其他非特異性結(jié)合條帶（圖2G）。通過His、Flag 標(biāo)簽特異性抗體成功鑒定到了相應(yīng)蛋白His-GATAD2A和MBD3-Flag，雖有非特異性結(jié)合條帶，但主帶信號(hào)強(qiáng)且條帶清晰（圖2E、2F）。根據(jù)分子量大小，Western blotting 檢測(cè)到的蛋白與考馬斯亮藍(lán)染色后SDS-PAGE 膠上的主要蛋白條帶基本吻合。以上結(jié)果均證實(shí)NuRD 復(fù)合物中的各主要組分蛋白被有效地共純化。

圖2 純化的NuRD復(fù)合物的Western blotting鑒定Fig 2 Western blotting identification of the purified NuRD complex

LC-MS/MS 鑒定結(jié)果顯示，純化得到的復(fù)合物終產(chǎn)物中含有NuRD 復(fù)合物的染色質(zhì)重塑模塊蛋白GATAD2A/B、MBD2/3、CHD3/4 及組蛋白去乙?；K蛋白MTA1/2/3、RBBP4/7、HDAC1/2。分別以蛋白群組中鑒定到的二級(jí)肽段譜圖數(shù)（peptide spectrum matches，PSMs）排序，可粗略估計(jì)各蛋白的相對(duì)含量，如表1 所示。上述結(jié)果表明純化得到的產(chǎn)物為NuRD復(fù)合物。

表1 純化的NuRD復(fù)合物樣品蛋白組分LC-MS/MS分析結(jié)果Tab 1 Analysis of protein components in the purified NuRD complex by LC-MS/MS

2.3 NuRD 復(fù)合物的負(fù)染電鏡數(shù)據(jù)收集和三維模型構(gòu)建

在獲得高純度且均一性較好的NuRD 復(fù)合物蛋白樣品后，通過負(fù)染電鏡技術(shù)和單顆粒重構(gòu)技術(shù)分析復(fù)合物的三維模型。樣品吸附到經(jīng)親水化處理的碳膜銅網(wǎng)后，經(jīng)重金屬UA 染色，通過120 kV 透射電鏡觀察，樣品在負(fù)染條件下蛋白質(zhì)濃度合適，顆粒分散性、均一性良好，雖存在少量細(xì)小的小蛋白顆粒，但不影響后續(xù)的顆粒挑選及結(jié)構(gòu)解析。電鏡照片中大部分顆粒為長(zhǎng)條形，長(zhǎng)度為25～32 nm，與預(yù)期大小基本相符，其長(zhǎng)度差異可能體現(xiàn)復(fù)合物不同角度下的截面狀態(tài)（圖3A）。在57 000放大倍數(shù)下共收集負(fù)染電鏡照片233 張，運(yùn)用RELION3.1.1 軟件挑選顆粒并進(jìn)行二維分類和三維分類分析。二維分類下，NuRD 復(fù)合物結(jié)構(gòu)特征明顯，大部分呈現(xiàn)出多節(jié)球狀樣的形態(tài)（圖3B），用于三維重構(gòu)的顆粒角度分布均勻（圖3C）。經(jīng)過進(jìn)一步的三維優(yōu)化處理，最終獲得分辨率約為17 ?（1 ?=0.1 nm）的人源NuRD 復(fù)合物負(fù)染三維結(jié)構(gòu)模型（圖3D）。

圖3 NuRD 復(fù)合物的負(fù)染電鏡分析Fig 3 Negative-staining electron microscopy analysis of the NuRD complex

2.4 NuRD 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的初步分析

針對(duì)生成的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，NuRD 復(fù)合物的大小約為270 ?×100 ?×80 ?，呈現(xiàn)為多節(jié)球狀的長(zhǎng)條形，具有與對(duì)稱二聚體較為吻合的模塊，但整體的NuRD 復(fù)合物呈現(xiàn)出一定的不對(duì)稱性（圖4A），其輪廓和已報(bào)道的亞復(fù)合物MTA1-HDAC1-MBD2、MTA1-HDAC1-MBD2-RBBP4 結(jié)構(gòu)輪廓有所類似［18］。將PBD 中已有的亞復(fù)合物結(jié)構(gòu)（7AO9，5FXY）通過UCSF Chimera自動(dòng)匹配［21］，大致確定對(duì)稱的二聚體MTA1-HDAC1、2 個(gè)RBBP4 亞基及MBD2 亞基在NuRD復(fù)合物負(fù)染結(jié)構(gòu)模型中的定位（圖4B）。另外，通過三維結(jié)構(gòu)模型信息可以推測(cè)其他亞基的定位，其中，MBD2 附近的多余電鏡密度可能為GATAD2A/B亞基，HDAC1 旁的多余電鏡密度可能為RBBP4/7亞基。

圖4 NuRD復(fù)合物三維模型結(jié)構(gòu)和多亞基的定位Fig 4 Three-dimensional reconstruction of NuRD complex and localization of multiple domains

3 討論

由于在基因轉(zhuǎn)錄和DNA 損傷修復(fù)及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，NuRD 復(fù)合物一直是表觀遺傳學(xué)及腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［12-13，23-24］。相較于NuRD 復(fù)合物的功能研究，關(guān)于完整NuRD 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究較為缺失。解析NuRD 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于揭示復(fù)合物中各亞基組成及相互作用關(guān)系、研究NuRD 復(fù)合物影響基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制、進(jìn)一步揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程及研發(fā)后續(xù)的治療藥物具有重大意義。

有研究［25］表明，染色質(zhì)結(jié)合蛋白PWWP2A/B（PWWP domain-containing protein 2A/B）能與MBD2/3等組分競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合染色質(zhì)重塑模塊（MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7），形成穩(wěn)定復(fù)合物，使去乙酰化核心模塊（MTA1/2/3-HDAC1/2-RBBP4/7）招募染色質(zhì)重塑模塊的能力減弱，這可能造成在選擇去乙酰化核心模塊添加純化標(biāo)簽進(jìn)行親和純化時(shí)難以純化得到完整NuRD 復(fù)合物。與之前的研究不同，我們將蛋白純化重點(diǎn)從較為穩(wěn)定的組蛋白去乙?；诵哪K轉(zhuǎn)向染色質(zhì)重塑模塊。經(jīng)過Ni-NTA 純化和Flag 標(biāo)簽純化，首次分離純化得到了完整NuRD 復(fù)合物。通過凝膠過濾層析Superose 6 Increase 5/150按分子量進(jìn)一步分離，為后續(xù)的電鏡結(jié)構(gòu)研究提供了更為均一完整的復(fù)合物狀態(tài)的蛋白樣品。之后，運(yùn)用負(fù)染電鏡和單顆粒重構(gòu)技術(shù)，獲得了NuRD 復(fù)合物的低分辨率結(jié)構(gòu)模型。從整體輪廓上看，NuRD復(fù)合物呈現(xiàn)出條形、多節(jié)球狀樣的結(jié)構(gòu)特征。已有的亞復(fù)合物MTA1-HDAC1-MBD2 及RBBP4 結(jié)構(gòu)可以通過UCSF Chimera 軟件較好地自動(dòng)匹配進(jìn)去，其他多余密度推測(cè)可能為GATAD2A/B、RBBP4/7 等亞基組分，但染色質(zhì)重塑模塊中的CHD4 亞基由于分子量較大，難以在我們解析得到的結(jié)構(gòu)模型中找到合適的定位空間。我們推測(cè)由于在純化產(chǎn)物中CHD4 的含量較低，最終得到的含有CHD4 的完整NuRD 復(fù)合物可能較少， 以至于后續(xù)使用RELION3.1.1 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析數(shù)據(jù)處理時(shí)二維、三維分類挑選到的顆粒大多為缺失CHD4 組分的亞復(fù)合物，最終得到的結(jié)構(gòu)模型可能為缺失CHD4 亞基的亞復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型。在后續(xù)的研究中，可通過額外添加CHD4 蛋白進(jìn)行體外組裝的方式提高復(fù)合物中CHD4 的含量，以期得到更多更為完整的NuRD復(fù)合物用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。

受限于負(fù)染電鏡結(jié)構(gòu)解析的局限性，染色劑中的重金屬可能會(huì)遮蔽部分結(jié)構(gòu)信息，且在吸附過程中，所涉及的分子力可引起構(gòu)象變化，使負(fù)染電鏡解析的結(jié)構(gòu)信息與真實(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)間存在些許差異。另外，負(fù)染電鏡結(jié)構(gòu)解析只能提供粗略的輪廓信息，精確的亞基定位及相互作用信息還需要進(jìn)一步通過冷凍電鏡高分辨率結(jié)構(gòu)解析提供依據(jù)。為了得到完整人源NuRD 復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，未來可通過加入交聯(lián)劑戊二醛的方式提高復(fù)合物的完整穩(wěn)定性，獲得更為均一的樣品，進(jìn)行冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析，從而獲得NuRD 復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)；另外，也可嘗試尋找合適的核小體底物進(jìn)一步穩(wěn)定復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，解析核小體-NuRD 復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，進(jìn)而闡明NuRD 復(fù)合物在基因表達(dá)調(diào)控上的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

黃晶設(shè)計(jì)并指導(dǎo)了整個(gè)課題的研究；段昱娟參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并完成了所有的實(shí)驗(yàn)；段昱娟和黃晶參與了整篇論文的寫作與修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and supervised by HUANG Jing. DUAN Yujuan participated in research design and performed all experiments.The manuscript was drafted and revised by DUAN Yujuan and HUANG Jing. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-13

·Accepted：2022-03-07

·Published online：2022-04-26