β-葡聚糖聯合低交聯透明質酸鈉在機體內應用的再生評價

方明星　吳偉東　王瑛等

中圖分類號：R622 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2022）02-0001-07

β-葡聚糖是一種天然的多糖類化合物，為水溶性或不溶性的顆粒，存在于細菌、真菌、植物等的細胞壁中[1，2]。研究發現[3-6]，β-葡聚糖具有多種生物學活性，如抗炎、降血糖血脂以及抗腫瘤等，且其代謝產物能夠調節膠原重組并刺激人Ⅰ型和Ⅲ型膠原再生等。β-葡聚糖注射進入皮膚組織后會激活朗氏細胞，且能與人成纖維細胞上特異性葡聚糖受體結合，被激活的朗氏細胞以及成纖維細胞能夠分泌一些因子，如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子等的表達，這些因子能夠促進成纖維細胞的增殖及皮膚基質（例如膠原蛋白、蛋白聚糖、彈性蛋白等）的合成[7-9]，合成的成纖維細胞及膠原纖維等能夠對葡聚糖形成包裹，形成Ⅰ型和Ⅲ型膠原，起到填充占位的效果。透明質酸鈉是一種線性單鏈糖胺聚糖聚合物，由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸組成，其分子結構相對穩定，因此可在不冷藏的情況下儲存長達2年[10，11]。此外，由于其極強的親水性，可以為皮膚補充水份。研究表明[12]，HA相對寡糖降解產物能夠積極刺激內皮細胞的增殖和遷移，并在延遲血運重建模型中誘導血管生成，且通過交聯的透明質酸鈉具有較強的機械屬性，能夠在組織中維持更長的時間，進而達到促進組織再生的目的。透明質酸鈉的粘彈性、生理活性和生物相容性使其成為藥理學應用的理想材料，特別是在眼科和風濕病學方面。此外，基于透明質酸鈉分子化學修飾產生的生物相容性和可降解的生物材料被廣泛的應用于傷口覆蓋、組織工程和醫療美容當中。但外源性的透明質酸在體內容易被透明質酸酶水解，且降解速度快，難以維持持久的效果[13]。因此，本研究主要探討β-葡聚糖聯合低交聯透明質酸鈉在機體內的安全性以及對新生血管及膠原生成的影響，現報道如下。

1.1實驗主要材料 注射材料主要包括β-葡聚糖（上海源葉，S24487）;注射用低交聯透明質酸鈉凝膠（廣州小蠻腰醫療器械有限公司，國械注準20153130014，規格：1.0ml/支×30g注射針2只）。β-葡聚糖和低交聯透明質酸鈉配置方法：將3mlβ-葡聚糖溶液與1ml低交聯透明質酸鈉凝膠在室溫下充分的混合至質地均勻。

1.2實驗試劑的分組及配置 具體試劑組合及各組試劑成分見表1。

1.3實驗動物分組及處理方法 選用周齡在6周，體重（200±20）g的SPF級Wistar大鼠30只。將大鼠分籠飼養，飼養條件為室溫（25±2）℃，相對濕度（50±5）%，12h明暗交替，自由攝食、飲水。將Wistar大鼠按照實驗組合①～⑤分為低交聯透明質酸鈉組、交聯透明質酸鈉（大分子）組、β-葡聚糖組、β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉組、交聯透明質酸鈉（大分子）+低交聯透明質酸鈉組，每組6只。選取脊柱旁兩側1.5～2cm皮下組織為注射中心點，利用針頭刺入表皮至皮下組織層（深度約4mm），回抽無血液后進行注射，每個部位注射材料劑量為1ml。以注射點為中心對周圍約1.5cm的范圍進行標注。各組大鼠注射材料后分別飼養7、14、28d，然后采用脊髓脫臼法處死各組的大鼠。剔除大鼠背部毛發，對馬克筆標注的注射區域用手術刀切開皮膚全層，取下組織樣本，先用相機拍照，記錄整體形態。切取包括植入材料在內的皮下組織，置于體積分數10%甲醛溶液中，固定48h后常規脫水、透明、浸潤、包埋、常規切片、切片厚度為3μm。本研究符合動物倫理要求，且經醫院倫理委員會審批通過。

1.4觀察指標 比較各組蘇木素-伊紅染色（HE）結果、膠原纖維含量面積百分比、HE染色切片中毛細血管及小血管數量。

1.4.1HE結果 在第7、14及28天處死大鼠，取植入材料在內皮下組織制成病理切片，在光鏡下觀察各組大鼠皮下組織結構、細胞浸潤情況、膠原纖維增生程度及新血管的生成情況等變化。

1.4.2膠原纖維含量面積百分比 參照相關文獻[14]，將制作好的病理切片用Canon450D數碼相機進行拍照，將圖片導入計算機Photoshop軟件（版本：AdobePhotoshopCS4）測量出整張圖片的面積測量值，然后用魔術棒功能選中膠原纖維區域再次進行測量記錄，分別測量切片中膠原纖維的面積測量值，計算膠原纖維含量百分比。膠原纖維含量百分比=膠原纖維面積測量值/整個圖片面積測量值×100%。

1.4.3HE染色切片中毛細血管及小血管數量 取注射部位皮下組織制作成HE染色切片，然后在顯微鏡下計數毛細血管密度，每個切片中取5個視野計數，然后取平均值作為毛細血管密度。

1.5統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行分析。

計量資料以[n（%）]表示，組間比較分別采用H檢驗和SNK-q檢驗;計量資料以（x±s）表示，組間比較采用χ檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2.1HE染色結果 低交聯透明質酸鈉組在第7天的HE染色切片中能夠看到少量的纖維組織增生并伴有炎細胞浸潤表現;第14和28天的HE染色切片中能夠看到膠原纖維增生更加明顯并伴有巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤;第28天的HE染色切片中毛線血管及小血管數量明顯增多，見圖1。交聯透明質酸鈉（大分子）組在第7天的HE染色切片中能夠看到注射部位周圍有膠原纖維及纖維組織增生，增生的膠原纖維及纖維組織內有較多的炎細胞浸潤;第14及28天的HE染色切片中可見膠原纖維及纖維組織增生明顯，增生的膠原纖維及纖維組織內伴有新生毛線血管及較多炎細胞浸潤，炎性細胞包括中性粒細胞、巨噬細胞等，見圖2。β-葡聚糖組在第7天HE染色切片中可以看到注射部位有膠原纖維及纖維組織增生，增生的膠原纖維排列緊密期間伴有少量炎細胞浸潤，并且可以見到有少量新生毛細;第14及28天的HE染色切片中仍可見到膠原纖維及纖維組織增生，但排列更加疏松并且伴有脂肪細胞浸潤，見圖3。β-葡聚糖+低交聯透明質酸組在第7天的HE染色切片中見注射部位周圍膠原纖維及纖維組織增生伴炎細胞浸潤，例如中性粒細胞、巨噬細胞等，增生的膠原纖維及纖維組織與周圍組織排列緊密;第14及28天的HE染色切片中可見膠原纖維及纖維組織增生更加顯著并且伴有毛細血管新生，增生的膠原纖維及纖維組織排列整齊，對注射部位的材料形成包裹，組織炎癥細胞浸潤較少，見圖4。交聯透明質酸鈉（大分子）+低交聯透明質酸鈉組在第7天的HE染色切片中見膠原纖維圍繞注射部位材料周圍及中間增生;第14天HE染色切片中可見膠原纖維及纖維組織增生較第7天明顯并且對注射部位形成包饒，增生的膠原纖維及纖維組織密度不均并伴有新生的毛細血管及微小血管，炎細胞浸潤明顯;第28天HE染色切片可見這種增生更加明顯并且密度不均勻、排列不整齊，見圖5。

圖1 低交聯透明質酸鈉組染色結果（HE×40）

圖2 交聯透明質酸鈉組染色結果（HE×40）

圖3 β-葡聚糖組染色結果（HE×40）

圖4 β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉組染色結果（HE×40）

圖5 交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸鈉組染色結果（HE×40）

2.2各組大鼠膠原纖維含量面積比較 各組大鼠切片圖像膠原纖維含量面積比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉組膠原纖維含量最高，其次是交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸鈉組，低交聯透明質酸鈉組、交聯透明質酸鈉組和β-葡聚糖組膠原纖維含量低于前兩組，見表2。

2.3各組大鼠HE染色切片中毛細血管及小血管數量比較 交聯透明質酸鈉組和β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉組的毛細血管及小血管數量高于低交聯透明質酸鈉組、β-葡聚糖組和交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸鈉組，差異有統計學意義（P<0.05）;交聯透明質酸鈉組與β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉組的毛細血管及小血管數量比較，差異無統計學意義（P>0.05）;低交聯透明質酸鈉組與β-葡聚糖組和交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸鈉組的毛細血管及小血管數量比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

透明質酸鈉又可稱為玻尿酸，因其含有大量的羥基和羧基，且能與水結合形成氫鍵，故具有很強的保水能力;能夠吸進水分進入細胞間隙并且與體內的蛋白質結合形成蛋白凝膠，從而加快皮膚修復能力和傷口再生能力，目前已廣泛應用于化妝品及組織工程中。但透明質酸鈉易溶于水，且容易被透明質酸酶水解，在化妝品及組織工程等實際應用中難以維持持久的治療效果，因此減緩其在體內的降解速度成為了研究重點。

近年來除了透明質酸鈉外，具有修復功效的化妝品原料在也逐漸備受關注。繼蛋白質、活性肽、氨基酸等修復成分之后，生物多糖成為了新的應用熱點。葡聚糖就是一種典型的生物多糖，是以葡萄糖為單糖組成的的多糖且葡萄糖單元之間以糖苷鍵相連接，根據其糖苷鍵的類型可分為α-葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖主要為機體供能而不具備生物活性功能，β-葡聚糖具有多種生物學功能，例如保濕、抗炎、抗過敏、降血糖、降血脂、增強免疫力等[15]。隨著臨床對葡聚糖不斷深入的研究[16]，發現β-葡聚糖還能夠通過激活巨噬細胞產生表皮生長因子及膠原蛋白和血管生長因子，從而加速加速新血管測生成和皮膚再生能力。β-葡聚糖不僅能夠增加巨噬細胞吞噬作用和增殖活性[17-19]，而且能夠增加巨噬細胞在創傷區域的滲入、膠原沉積并且能夠增強傷口的抗牽拉強度[20]。另有研究表明[21-24]，β-葡聚糖能夠刺激血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子等的表達。而血管內皮生長因子在調節內皮細胞遷移、存活、增殖、分化及新血管生成中起關鍵作用[25-27]。盡管β-葡聚糖有諸多優點，但β-葡聚糖在體內通常難以降解并且降解時間較長，但有研究發現[28-30]，β-葡聚糖與透明質酸鈉反應后不僅能夠克服β-葡聚糖難以降解的缺點，還能夠克服透明質酸鈉極易水解的缺點，聯合使用后能夠集兩者的生物活性為一體同時克服自身單獨使用的缺點。

本研究以不同分子量的透明質酸鈉和β-葡聚糖為實驗試劑，通過不同的組合方式來評價β-葡聚糖和（或）透明質酸鈉在體內應用的再生能力，結果發現注射β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉的實驗方式相較于其他注射部位有更多的新生血管生成，鏡下膠原纖維密度更高，考慮與β-葡聚糖能夠增加巨噬細胞吞噬作用和增殖活性以及各種因子表達有關，從而促進膠原纖維在局部的沉積及新血管的生成。交聯透明質酸鈉組的膠原纖維增生及新生的毛細血管及小血管數量接近于β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉組，考慮到與交聯透明質酸鈉分子結構更加穩定，在體內分解速度更慢，維持時間長有關，能夠在體內維持長時間的再生效果。當交聯透明質酸鈉與低交聯透明質酸鈉二者聯合應用時，與β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉在體內的膠原纖維再生能力無明顯差異，交聯透明質酸鈉能夠在一定程度上彌補低交聯透明質酸鈉在體內被透明質酸酶分解過快的缺點，這一特性與β-葡聚糖類似，因此兩種組合在體內再生能力也無明顯差異。交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸鈉與β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉兩種組合在體內再生效果雖然類似，但是在組織切片中交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸注射材料周圍炎性細胞浸潤更為明顯，表明β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉在體內應用時的組織相容性優于交聯透明質酸鈉+低交聯透明質酸鈉。低交聯透明質酸鈉、β-葡聚糖二者單獨應用在體內再生效果類似，當二者聯合應用時體內再生能力優于二者單獨應用。本實驗證明了β-葡聚糖聯合透明質酸鈉皮下注射在體內膠原纖維及毛細血管再生能力對比其他組合較強。在本實驗中注射β-葡聚糖+低交聯透明質酸鈉的部位未見明顯的炎性包裹，提示β-葡聚糖與低交聯透明質酸能夠二者互補并且克服自身單獨應用的缺點。

綜上所述，β-葡聚糖聯合低交聯透明質酸鈉皮下注射具有良好的組織相容性，對新生血管生成及新生膠原具有明顯且較安全的作用。但目前關于β-葡聚糖聯合透明質酸鈉的作用機制和理化性質認識較為有限，且二者聯合應用的副作用研究甚少，如何制備出安全且而高效能的組合配方仍需進一步研究。另外，本實驗并未對β-葡聚糖聯合透明質酸鈉最佳配比進行研究，且考慮到β-葡聚糖和交聯透明質酸鈉二者本身在體內代謝時間長的問題，并未對著兩種試劑進行組合。在后續的研究中，還需進一步研究β-葡聚糖與透明質酸鈉最優配比及不同配比在體內的再生評價。