CRYAB在肺鱗癌中的表達及其臨床意義

卞春安 田曉奇 林超宇 許里

肺鱗狀細胞癌(LUSC)是非小細胞肺癌(NSCLC)第二大組織學亞型，不同于肺腺癌，各類針對驅動基因的TKI及免疫治療藥物在肺鱗癌中進展緩慢，晚期肺鱗癌病人的5年生存率小于15%，總體預后不佳[1-2]。 小熱休克蛋白(sHsps)是一個龐大的蛋白家族，人類基因組包含10個編碼sHsps的基因[3]。其中HspB4(CRYAB)在多種細胞類型中出現異常表達并可針對凋亡刺激、氧化應激等情況調節細胞功能。多項研究指出，CRYAB在乳腺癌、頭頸腫瘤、膠質瘤、卵巢癌中同樣存在異常表達及其并與腫瘤的多種惡性生物學行為顯著相關[4-5]。我們首先采用qPCR法檢測20例肺鱗癌組織中的CRYAB mRNA的表達水平，初步證實了CRYAB在肺鱗癌組織中為高表達，進一步采用免疫組織化學法檢測了59例肺鱗癌組織芯片中的CRYAB蛋白的表達情況，結合相應病人的臨床病例資料，探討CRYAB表達水平與肺鱗癌病人臨床病理特征及預后的關系。

對象與方法

一、對象

標本來源：肺鱗癌病人組織標本20例，為2014年1月～2016年12月收治的肺鱗癌手術病人。免疫組化實驗的59例肺鱗癌病人組織芯片購買于上海芯超生物科技有限公司[6]。

肺鱗癌病人組織芯片59例， 男性54例，女性5例，年齡60～78歲；腫瘤直徑≥3 cm 56例，<3 cm 3例；病理類型Ⅰ～Ⅱ級43例，Ⅲ～Ⅳ級16例；脈管侵犯4例；淋巴結陽性24例，遠處轉移1例。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期21例。隨訪時間為1～91個月，平均46.8個月。見表1。

表1 CRYAB表達與59例肺鱗癌病人臨床病理特征關系(例)

二、方法

1.主要試劑 Trizol購自于Invitrogen公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，CRYAB抗體購自Abcam公司(Abcam,Cambridge,MA,USA)，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(BOSTER,Wuhan,China)。

2.RNA提取根據Trizol試劑盒說明步驟進行[7]。CRYAB引物序列如下:正向 5'-CTT TGA CCA GTT CTT CGG AG-3' ，反向 5'-CCT CAA TCA CAT CTC CCA AC-3';內參基因GAPDH的引物序列如下：正向5'-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3'，反向 3'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-5'。

3.SP免疫組化檢測按照所采購的試劑盒說明書進行[8]。通過免疫組化評分(immunohistochemical scores，IHS)進行判讀，以陽性細胞數≤10%判定為陰性，陽性細胞數>10%判定為陽性。免疫組化的結果判定由兩個高年資病理科醫生共同作出。

三、統計學分析

結果

1.20例癌和對應癌旁組織中CRYAB mRNA表達情況見圖1。結果顯示，癌組織和癌旁組織CRYAB mRNA表達分別為4.456±1.5120和(2.944±0.4907，兩組比較其差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 CRYAB mRNA在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達

2.免疫組化檢測：免疫組化結果顯示，59例肺鱗癌病人中，有23例(38.98%)CRYAB蛋白高表達，其表達產物主要位于腫瘤細胞胞漿(圖2)；對應的癌旁正常組織病例僅有8例(13.56%)顯示CRYAB蛋白高表達，其差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 CRYAB在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(SP×400)

3.CRYAB表達與肺鱗癌臨床病理特征的關系：CRYAB的表達與LUSC臨床指標中T分期顯著相關(P<0.05)。見表1。

4.生存分析：單因素分析顯示，CRYAB的表達及T分期與病人的總生存期有關(P<0.05)。進一步多因素Cox回歸分析證實，CRYAB的表達和T分期是肺鱗癌病人的獨立預后因素(P<0.05)，見表2。Kaplan-Meier生存曲線顯示，肺鱗癌病人中高表達CRYAB的預后不佳(圖3)。

表2 單因素及多因素Cox回歸分析預后相關因素

圖3 CRYAB及腫瘤直徑與病人總生存期的關系

討論

CRYAB最初被發現存在于眼球晶狀體中，同樣也在身體的其他部位，例如心臟，骨骼肌，卵巢等有表達[9]。CRYAB可作為分子伴侶，在細胞遇到外在壓力如輻射和過氧化時，抑制細胞聚集，防止細胞變性，促進細胞存活，抑制細胞凋亡[10]。近年來，CRYAB與腫瘤發生發展的關系逐漸引起關注[4]。CRYAB可在多種惡性腫瘤異常表達，如頭頸腫瘤、乳腺癌、肝癌、腎細胞癌[11-14]；CRYAB可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為[15]；CRYAB高表達的腫瘤病人預后不佳[10]。而關于CRYAB在腫瘤中的作用機制研究亦逐漸深入，Huang等[16]報道，CRYAB可誘導肝癌細胞上皮間質轉化，并通過激活ERK1/2/Fra-1/slug信號通路介導索拉非尼耐藥；Guo等[17]報道CRYAB可影響M2型腫瘤相關巨噬細胞的極化并促進非小細胞肺癌轉移；Ruan等[18]報道，CRYAB可通過促進血管內皮生長因子(VEGF)表達并誘發乳腺癌抗血管治療抵抗作用。

本研究首先收集了20例肺鱗癌病人的腫瘤組織及對應癌旁組織，通過qPCR檢測，了解CRYAB mRNA的表達情況。結果顯示，CRYAB mRNA在肺鱗癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義；我們進一步使用免疫組化法檢測了包含59例肺鱗癌標本及其對應癌旁標本的組織芯片，結果發現CRYAB在肺鱗癌組織中的異常高表達。采用單因素及多因素風險回歸模型分析59例肺鱗癌病人預后相關因素。單因素分析提示，CRYAB表達及T分期是預后不良指標；多因素分析表明，CRYAB高表達及T分期是肺鱗癌的不良預后的獨立影響因素。以上結果均與關于CRYAB的多項研究結果相符，均提示CRYAB的“促腫瘤”特性并與預后不佳顯著相關[7,10-11,15]。有研究表明，CRYAB在鼻咽癌中還可發揮“抑制腫瘤”作用，且CRYAB的表達和頭頸部鱗癌預后無關[19-20]。這說明CRYAB在不同類型腫瘤發生發展中功能的多樣性及復雜性。本實驗樣本量偏少，后續仍需收集更多的樣本，以期獲得更加可靠的實驗數據。

綜上所述，CRYAB在肺鱗癌組織中異常高表達，CRYAB的表達水平和肺鱗癌的腫瘤直徑是肺鱗癌預后的獨立危險因素。CRYAB標志物的發現，可為肺鱗癌的診療提供新的研究方向。