羊肉及其制品中狐源成分的定量檢測(cè)

項(xiàng)愛麗，湯思凝，張誼，石亮，王秋悅*，鄭百芹*

1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（唐山 063000）；2.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院（秦皇島 066000）；3.河北省秦皇島昌黎農(nóng)業(yè)農(nóng)村局（昌黎 066600）

隨著肉制品在人們飲食中的增加，其質(zhì)量問(wèn)題成為消費(fèi)者面臨的一大難題。尤其是在歐洲馬肉丑聞[1]之后，在全球范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)在昂貴的肉中摻雜入低成本肉類以獲得高額利潤(rùn)的情況，使得檢測(cè)加工肉類中摻雜不需要的食品成分成為最重要的食品質(zhì)量問(wèn)題[2]。在我國(guó)，羊肉及其肉制品因其高品質(zhì)的蛋白質(zhì)和低脂肪在消費(fèi)者中流行。然而，羊肉中經(jīng)常摻雜廉價(jià)或品質(zhì)較差的肉類。我國(guó)北方毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖量較大，每年都有大量狐貍胴體出現(xiàn)，該動(dòng)物肉中往往會(huì)含有對(duì)人體有害的獸藥殘留，如若摻有其肉則具有較高的食品安全隱患。因此，用快速、靈敏和準(zhǔn)確的方法鑒定羊肉及其肉制品中是否含有狐源成分具有重要意義。

多種摻假檢測(cè)方法被開發(fā)，包括基于形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)和核酸的檢測(cè)分析方法[3-6]。其中，基于形態(tài)學(xué)的組織檢測(cè)僅能做出初步的定性檢測(cè)，不能做出定量判斷；對(duì)于其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，操作繁瑣，對(duì)試驗(yàn)操作要求較高?；诘鞍踪|(zhì)的檢測(cè)，由于蛋白受熱變性的特點(diǎn)，該方法不適于肉制品，更適用于冷鮮肉的摻假檢測(cè)。核酸分子的高度穩(wěn)定性，使得基于核酸的PCR檢測(cè)技術(shù)在加熱肉制品中也同樣具有靈敏度高、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)和用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于肉類及其肉制品的種屬鑒別[7-10]。

針對(duì)狐貍線粒體細(xì)胞色素特定區(qū)域的cytB基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化建立的反應(yīng)條件對(duì)引物的特異性、靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證和穩(wěn)定性評(píng)估，用該方法定性和定量檢測(cè)羊肉及其制品中狐源成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞、豬、鴨、羊鮮肉及肉制品（秦皇島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和大型超市）；狐、狐貍、貂鮮肉樣品（河北科技師范學(xué)院）；磁微粒DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；引物[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。

Nanodrop2000核酸蛋白定量?jī)x（Thermo Scientific，USA）；DYY-6D型電泳儀（北京市六一儀器廠）；高速離心機(jī)（FC5515R）；臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16G）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

將雞、豬、鴨、羊、狐、狐貍、貂7種新鮮肉樣用清水洗凈，取肉樣中心部位去除結(jié)締組織及脂肪組織，將剩余的肌肉組織剪成約1 g的小塊，置于凍存管于液氮中保存?zhèn)溆?。將羊肉、狐肉樣品按照?進(jìn)行混合，得到不同含量狐肉的混合樣品。將所有樣品用液氮研磨成粉末狀，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 羊肉和狐肉不同混合比例

1.2.2 DNA提取

取適量上述研磨的樣品于1.5 mL離心管中。按照說(shuō)明書的操作步驟使用磁微粒DNA提取試劑盒對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行DNA提取，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA濃度和純度測(cè)定

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的完整度。用Nanodrop 2000測(cè)定核酸濃度，記錄A260/A280及A260/A230值，分析所提核酸純度。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)

以線粒體細(xì)胞色素cytB為特異性基因，采用NCBI Blast、Oligo 7、DNAMAN等軟件將狐貍源序列與豬、羊、雞、鴨、貉、貂6個(gè)物種序列進(jìn)行比對(duì)，篩選不同種物種間差異靶序列設(shè)計(jì)特異性引物N2，序列為：F，5’-CCCTCCTGGGAATCTGCCTA-3’；R，5’-GCTCCGTTTGCGTGTATGTATC-3’。

選擇同物種間序列較為保守的片段16S rDNA基因?yàn)橥ㄓ靡锘?，序列為：F，5’-ACCGTGCAAAGGTAGCATAATCA-3’；R，5’-GCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT-3’。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR體系及反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR Super Mix 10 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，模板DNA 1 μL。經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化確定最終反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，95 ℃ 15 s；60℃ 1 min；95 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 引物特異性及內(nèi)參引物通用性檢測(cè)

以N2作為PCR反應(yīng)的上下游引物，去離子水作陰性對(duì)照，以豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉、狐肉、貉肉、貂肉組織DNA作為PCR反應(yīng)體系模板，稀釋濃度50 ng/μL，每個(gè)物種設(shè)置3個(gè)平行檢測(cè)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果分析引物特異性。

同時(shí)以16S rDNA作為內(nèi)參基因，以7個(gè)物種組織基因組為PCR反應(yīng)體系模板，稀釋濃度為50 ng/μL，去離子水作陰性對(duì)照，每個(gè)物種設(shè)置3個(gè)平行檢測(cè)，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果分析內(nèi)參基因引物通用性。

1.2.7 靈敏度檢測(cè)

將提取的羊肉DNA稀釋至50 ng/μL，然后進(jìn)行5倍濃度的倍比稀釋，即50 ng/μL，10 ng/μL，2 ng/μL，400 pg/μL，80 pg/μL，16 pg/μL，3.2 pg/μL和0.64 pg/μL濃度梯度，取無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)擴(kuò)增曲線判斷引物的靈敏度。

1.2.8 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將表1中狐羊混合肉樣提取DNA，稀釋濃度統(tǒng)一至50 ng/μL，將表1中樣品1～6號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用x±s表示。標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值差值ΔCt值（ΔCt=Ct狐貍-Ct內(nèi)參）與狐肉含量均呈線性相關(guān)，以標(biāo)準(zhǔn)品中狐肉含量為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值差值ΔCt為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性驗(yàn)證

將表1中樣品7～11號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)檢測(cè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行。通過(guò)記錄模擬樣品在特異性基因和內(nèi)參基因檢測(cè)體系擴(kuò)增信號(hào)的Ct值，代入建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，可以得知對(duì)應(yīng)的DNA模板濃度，進(jìn)一步計(jì)算模擬混合樣品中狐源成分的相對(duì)含量。根據(jù)已知模擬樣品狐肉的含量，對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回收率分析，從而驗(yàn)證所建立的實(shí)時(shí)熒光量檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度與純度測(cè)定結(jié)果

DNA濃度與純度測(cè)定結(jié)果見表2，核酸濃度在530～600 ng/μL，1.8＜A260/A280＜1.9說(shuō)明所提取的核酸中無(wú)RNA及蛋白質(zhì)污染，A260/A230＞2所提取的核酸中無(wú)碳水化合物的污染。由圖1可以看到，所提核酸條帶較亮，無(wú)明顯的拖帶現(xiàn)象，磁珠法所提取的核酸完整性較好，純度和濃度均達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求。

表2 DNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果

圖1 各肉類基因組DNA提取電泳圖

2.2 引物特異性檢測(cè)結(jié)果

以7個(gè)物種的核酸為模板進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，檢驗(yàn)引物N2的特異性。由圖2可以看出，狐貍DNA曲線起跳點(diǎn)為第12循環(huán)開始，其他6個(gè)物種的起跳點(diǎn)為第22或第26循環(huán)開始，且狐貍DNA所擴(kuò)增曲線較穩(wěn)定，可以很好地與其他幾個(gè)物種區(qū)分，特異性較強(qiáng)。

圖2 引物N2對(duì)不同肉類DNA的擴(kuò)增曲線

圖3為狐貍特異性引物N2的熔解曲線，峰值溫度為84 ℃，熔解曲線為單峰，無(wú)雜峰，表明引物無(wú)二聚體產(chǎn)生，符合試驗(yàn)要求。

圖3 引物N2擴(kuò)增熔解曲線

2.3 內(nèi)參引物通用性檢測(cè)結(jié)果

以7個(gè)物種的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)引物16S rDNA的通用性。由圖4可以看出，所擴(kuò)增曲線都集中在一個(gè)較小的范圍內(nèi)，擴(kuò)增的曲線較穩(wěn)定，通用性較強(qiáng)。圖5為通用引物16S的熔解曲線，熔解曲線的溫度為82.04 ℃，熔解曲線為單峰，無(wú)雜峰，無(wú)引物二聚體。

圖4 不同肉類DNA中引物16S的擴(kuò)增曲線

圖5 16S擴(kuò)增熔解曲線

2.4 引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果

將狐貍DNA稀釋至50 ng/μL，進(jìn)行5倍梯度稀釋，以不同濃度DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，結(jié)果見圖6。核酸DNA濃度16 pg/μL時(shí)，擴(kuò)增曲線可以很好地與陰性對(duì)照無(wú)酶水區(qū)分，而核酸DNA濃度3.2 pg/μL時(shí)，則擴(kuò)增曲線與無(wú)酶水相同，不能相區(qū)分，因此該引物的最低檢測(cè)限為16 pg/μL。

圖6 引物N2對(duì)不同濃度DNA的擴(kuò)增曲線

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

狐羊肉不同混合比例核酸DNA熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。以狐肉含量的log10值為橫坐標(biāo)，以ΔCt為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果為Y=-2.36X-0.731 6（圖7），E=98.25%＜105%，R2=0.995 6＞0.980，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。

圖7 混合狐肉含量ΔCt標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 不同含量狐肉Ct及ΔCt值檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式為Y=-2.36X-0.731 6，R2=0.995 6

2.6 模擬混合肉樣檢測(cè)結(jié)果

混合肉樣Ct值檢測(cè)結(jié)果見表4。通過(guò)將ΔCt代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸公式中得出狐肉含量，計(jì)算回收率，其范圍為99.12%～104.36%，結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)要求，具有實(shí)踐意義。

表4 模擬混合肉樣Ct值檢測(cè)結(jié)果

2.7 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性評(píng)估

采取重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)該方法的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，由表5可以看到組內(nèi)變異系數(shù)為0.39%～0.78%，組間變異系數(shù)為0.45%～1.60%，表明檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性。

表5 組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，肉類摻假的鑒別主要是在蛋白質(zhì)和核酸水平進(jìn)行的，基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)需要對(duì)樣品的處理及試劑和儀器要求比較高，且操作步驟繁瑣、費(fèi)事，特異性較差，費(fèi)用較高，而且經(jīng)過(guò)熱處理后其蛋白會(huì)發(fā)生變性，表位會(huì)發(fā)生改變，因此基于蛋白質(zhì)的肉類摻假檢測(cè)不適用于經(jīng)加工處理后的肉制品的檢測(cè)，僅受限于對(duì)新鮮生肉的檢測(cè)[11-12]?；贒NA核酸的檢測(cè)方法在此方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，DNA測(cè)序能鑒定出物種所具有的獨(dú)特的DNA序列。在靶序列的選擇上，篩選線粒體細(xì)胞色素特定區(qū)域的cytB基因，因其受到雙層線粒體膜的保護(hù)，能更好地抵抗肉制品在加熱加工過(guò)程的損傷，成為不同物種的獨(dú)特鑒定[13]。

實(shí)時(shí)熒光PCR是以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，它是在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)收集和檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)定性和定量分析。與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR特異性更強(qiáng)、動(dòng)態(tài)范圍更高，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，在肉類質(zhì)量檢測(cè)方面的研究及應(yīng)用也較為成熟[14-15]。實(shí)時(shí)熒光PCR主要包括SYBRGreen和TaqMan兩大類。SYBR Green熒光PCR是利用體系中的染料分子對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)鑒測(cè)，染料分子與DNA的結(jié)合會(huì)使熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR根據(jù)對(duì)熒光信號(hào)的分析實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本成分的定性和定量檢測(cè)。史瑩瑩等[16-17]通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)肉制品中的牛源性成分和羊源性成分，通過(guò)ΔCt值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其最低檢測(cè)限分別為0.64 pg/μL和16 pg/μL。王磊[18]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立對(duì)肉制品中鴨源性成分的鑒別和量化檢測(cè)方法，其鴨源性靈敏度可達(dá)10-3ng/μL鴨源DNA，檢出限為0.1%鴨肉含量。羅建興等[19]建立基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR在食品中的鵪鶉源性成分的定量檢測(cè)方法，鵪鶉組分DNA的檢出限可達(dá)10 fg/mL，靈敏度可達(dá)0.001%。

試驗(yàn)建立一種實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)羊肉中狐肉摻假量，實(shí)時(shí)熒光體系擴(kuò)增呈典型“S”型曲線且指數(shù)擴(kuò)增期明顯，建立熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-2.36X-0.731 6，最低檢測(cè)限為16 pg/μL。通過(guò)模擬混合肉樣計(jì)算其回收率在99.12%～104.36%之間，并通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)確定該方法的穩(wěn)定性。試驗(yàn)建立的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，可為羊肉及其肉制品中狐貍源成分的快速定性定量檢測(cè)提供參考。