淡水魚(yú)中的孔雀石綠和隱性孔雀石綠的快速提取和檢測(cè)

謝湘武，劉柳*，韋媛媛，粟暉，傳杰杰

1.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西科技大學(xué)（柳州 545006）；2.廣西壯族自治區(qū)計(jì)量檢測(cè)研究院（南寧 530007）

孔雀石綠（malachite green，MG；分子式C23H25ClN2），屬于三苯基甲烷型的染料，進(jìn)入人體或動(dòng)物機(jī)體后，很快代謝成毒性更強(qiáng)、更穩(wěn)定的隱性孔雀石綠（leuco malachite green，LMG；分子式C23H26N2），已被禁止作為抗菌劑、殺蟲(chóng)劑、消毒劑[1]使用在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海產(chǎn)品的運(yùn)輸途中。但由于孔雀石綠抗菌驅(qū)蟲(chóng)能力極強(qiáng)，優(yōu)于抗生素類(lèi)藥品，許多水產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖業(yè)仍在違規(guī)使用，屢禁不止[2-3]。

水產(chǎn)品中LMG、MG的提取方法主要分2步。第一步是溶劑提取。在GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量測(cè)定的高效液相色譜熒光檢測(cè)法》[4]和GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》[5]中，均采用乙腈-乙酸銨緩沖液提取殘留物，加入二氯甲烷進(jìn)行液液萃取。有學(xué)者[6]采用乙酸乙酯-正己烷-水對(duì)魚(yú)肉中的孔雀石綠進(jìn)行提取，采用側(cè)流層析免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，MG最低檢出限為1 ng/g。此外，丙酮-環(huán)己烷、乙酸乙酯-石油醚、乙腈-二氯甲烷提取體系常用于生物活性物質(zhì)的提取，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：丙酮-環(huán)己烷提取體系易使干擾物質(zhì)大量富集在提取液難以除去；乙酸乙酯-石油醚體系提取時(shí)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，且回收率低；用乙腈-二氯甲烷提取效果最為理想，對(duì)分析結(jié)果無(wú)干擾影響。因此，乙腈對(duì)細(xì)胞組織具有良好滲透作用和沉淀蛋白的作用，是LMG和MG的最佳提取溶劑[7]。第二步是凈化濃縮，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)大多采用中性或酸性氧化鋁固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行固相萃取凈化[8]，除去油脂和其他雜質(zhì)，再用N2吹干或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮[9-10]。此外，分子印跡聚合物（MIPs）和磁性分子印跡聚合物（MMIPs）[11]被廣泛用于對(duì)魚(yú)肉中MG和LMG的選擇性分離和富集，其中MMIPs不僅具有傳統(tǒng)MIPs高親和力的特點(diǎn)，還可以通過(guò)磁鐵快速輕松地分離，減少樣品前處理的時(shí)間。在文獻(xiàn)中尚未查詢(xún)到采用酸性氧化鋁粉末對(duì)魚(yú)肉樣品進(jìn)行分散凈化的方法。

試驗(yàn)在GB/T 19857—2005和相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化了樣品前處理方法，減少了固相萃取的時(shí)間并提高樣品加標(biāo)回收率；改進(jìn)使用硼氫化鉀粉末將孔雀石綠完全轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠[12-17]，有利于準(zhǔn)確定量，減少誤差和氫氣產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)隱性孔雀石綠總量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（TDL-5，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；電子分析天平（AL104，上海梅特勒-托利多公司）。

隱性孔雀石綠（99%），孔雀石綠（99%）；乙腈（色譜級(jí)）；中性氧化鋁（200～300目，即0.085～0.075 mm）；硼氫化鉀（AR）；酸性氧化鋁（200～300目，0.085～0.075 mm）；乙酸銨（AR）；冰醋酸（AR）；淡水魚(yú)（市售）。

1.2 色譜條件

乙腈-乙酸銨緩沖溶液（pH 4.6）=75∶25（V/V）；Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；LMG檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，MG檢測(cè)波長(zhǎng)610 nm，進(jìn)樣量20 μg/mL，流速1 mL/min。

1.3 不同提取方法的比較

在5 g不含MG和LMG的陰性樣品中分別添加1 mL 0.5 μg/mL的孔雀石綠和隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，基于GB/T 19857—2005的提取方法，進(jìn)行步驟刪減，考察不同提取方法的提取率。

1.3.1 國(guó)標(biāo)法提取

完全按照GB/T 19857—2005方法進(jìn)行提取。取5.0 g魚(yú)肉，添加穩(wěn)定劑（1 mL鹽酸羥胺溶液、2 mL對(duì)-甲苯磺酸溶液、2 mL乙酸銨緩沖液），加入40 mL乙腈均質(zhì)、離心，將上清液轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入20 mL乙腈清洗殘?jiān)喜⑸锨逡骸Ｔ诜忠郝┒分屑尤?0 mL二氯甲烷分2次萃取，取下層二氯甲烷層，旋蒸濃縮近干。凈化：用6 mL乙腈分3次洗滌溶解，過(guò)0.075～0.085 mm（即200～300目）中性氧化鋁層析柱和陽(yáng)離子交換柱，用2 mL乙腈洗脫，棄去中性氧化鋁柱，繼續(xù)用3 mL 2%甲酸、3 mL乙腈淋洗陽(yáng)離子交換柱，棄去流出液。用4 mL 5%（V/V）乙酸銨甲醇溶液洗脫陽(yáng)離子交換柱、用水定容至10 mL，濾液過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.2 不添加穩(wěn)定劑的國(guó)標(biāo)法提取

在GB/T 19857—2005方法的提取步驟中不添加穩(wěn)定劑（1 mL鹽酸羥胺溶液、2 mL對(duì)-甲苯磺酸溶液、2 mL乙酸銨緩沖液），其余提取方法步驟均不變，濾液進(jìn)高效液相色譜分析測(cè)定。

1.3.3 無(wú)萃取步驟的國(guó)標(biāo)法提取

在GB/T 19857—2005方法的提取步驟中無(wú)萃取步驟（不加入二氯甲烷進(jìn)行液液萃取），其余提取方法步驟均不變，濾液進(jìn)高效液相色譜分析測(cè)定。

1.3.4 快速提取方法提取

去掉魚(yú)鱗、魚(yú)皮和魚(yú)骨頭，取5 g可食部分魚(yú)肉，加入15 mL乙腈，在10 000 r/min勻漿機(jī)中勻漿30 s，加5 g酸性氧化鋁（200～300目，即0.085～0.075 mm）進(jìn)行分散凈化，用渦旋混勻器振蕩30 s后，在4 000 r/min高速離心機(jī)離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，得到待測(cè)樣本，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.5 提取方法重復(fù)性試驗(yàn)

制備含有LMG和MG加標(biāo)樣品，分別進(jìn)行快提法和國(guó)標(biāo)法提取，重復(fù)5次試驗(yàn)，測(cè)定LMG和MG殘留量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010 0 g孔雀石綠和隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈分別溶解定容至2個(gè)100 mL棕色容量瓶中，得到100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，各取1 mL儲(chǔ)備液稀釋成2 μg/mL的母液，依次稀釋成0.025～0.750 μg/mL的孔雀石綠和0.01～0.750 μg/mL的隱性孔雀石綠的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

1.5 方法學(xué)檢驗(yàn)

測(cè)定市售水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的含量，在市售水產(chǎn)品中添加一定量的孔雀石綠和隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度、檢出限試驗(yàn)。

1.6 孔雀石綠被還原為隱性孔雀石的轉(zhuǎn)化當(dāng)量計(jì)算

在5 g陰性樣品中，添加一定量孔雀石綠、硼氫化鉀粉末，通過(guò)反應(yīng)前后孔雀石綠的變化量及隱性孔雀石綠的生成量，計(jì)算轉(zhuǎn)化當(dāng)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同樣品前處理方法的提取率結(jié)果

在5 g陰性魚(yú)肉樣品中分別添加0.50 μg的MG和LMG，制備4份同時(shí)含有100 μg/kg LMG和100 μg/kg MG的加標(biāo)樣品，分別按照4種提取方法進(jìn)行提取，測(cè)定LMG和MG的含量。提取率結(jié)果如圖1和表1所示，快速提取法的提取率最高，LMG為99.1%，MG為77.1%，均高于其余3種提取方法。其中：國(guó)標(biāo)法使用乙腈-二氯甲烷進(jìn)行液液萃取，在振蕩后有部分樣品發(fā)生乳化，分層過(guò)程等待時(shí)間長(zhǎng)且乳化層含水量高，不利于后續(xù)試驗(yàn)；不加穩(wěn)定劑的國(guó)標(biāo)法，提取液清亮，易于過(guò)0.45 μm濾膜，但提取率不高；無(wú)萃取步驟的國(guó)標(biāo)法，提取液渾濁，旋蒸后復(fù)溶、固相萃取，洗脫液過(guò)0.45 μm濾膜困難，測(cè)定提取率為0.0%；快速提取法經(jīng)乙腈提取、酸性氧化鋁分散凈化，得到的提取液清亮，離心后易于過(guò)0.45 μm濾膜，提取率高于國(guó)標(biāo)法。

圖1 不同提取方法的加標(biāo)回收率

以快速提取法和國(guó)標(biāo)法平行5次重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。快速提取法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，優(yōu)于國(guó)標(biāo)法，重復(fù)性好，且MG和LMG的回收率高于國(guó)標(biāo)法。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 孔雀石綠和隱性孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

以色譜峰面積對(duì)濃度作圖，孔雀石綠和隱性孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

2.3 市售水產(chǎn)品的測(cè)定及加標(biāo)回收率

將市售淡水魚(yú)放在一個(gè)水箱中，殺魚(yú)并按照乙腈快速提取法提取，提取液分成2份，一份直接測(cè)定，另一份加入一定量的MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，測(cè)定樣品含量和樣品加標(biāo)含量，計(jì)算樣品回收率，如表3所示，孔雀石綠回收率為92%～108%，隱性孔雀石綠回收率為96%～108%，分析方法準(zhǔn)確可靠。淡水魚(yú)提取液的高效液相色譜圖，如圖2和圖3所示。

圖2 淡水魚(yú)中MG的高效液相色譜色譜圖

圖3 淡水魚(yú)中LMG的高效液相色譜色譜圖

表3 水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的加標(biāo)回收率

2.4 檢出限試驗(yàn)結(jié)果

取市售陰性草魚(yú)樣品，取5 g陰性魚(yú)肉樣品，準(zhǔn)確加入一定量的MG和LMG，按快提法提取，測(cè)定提取液中MG和LMG直至信噪比S/N等于3時(shí)，對(duì)應(yīng)檢出限如表4所示。MG的檢出限分別為0.005 μg/mL和20 μg/kg，LMG的檢出限分別為0.005 μg/mL和16 μg/kg。

表4 樣品檢出限的測(cè)定

2.5 孔雀石綠被還原為隱性孔雀石的轉(zhuǎn)化當(dāng)量

在最優(yōu)色譜條件下，取10 μg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液，共6份，每份1 mL，準(zhǔn)確加入0.3，0.9，1.2，5.1，10.1和15.1 mg硼氫化鉀粉末，離心，上清液過(guò)HLPC。孔雀石綠轉(zhuǎn)化結(jié)果如表5所示。0.3 mg硼氫化鉀即可將1 mL 10 μg/mL孔雀石綠百分之百還原為隱性孔雀石綠，即使加大硼氫化鉀粉末的用量，對(duì)于隱性孔雀石綠的含量幾乎沒(méi)有影響，6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%，1 μg孔雀石綠可以完全轉(zhuǎn)化為0.65 μg隱性孔雀石綠。

表5 孔雀石綠轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠

硼氫化鉀極易溶于水而難溶于乙腈，在已有文獻(xiàn)[18-19]中，采用硼氫化鉀水溶液加入孔雀石綠中使其轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，硼氫化鉀溶液在配制時(shí)不可避免地接觸空氣中的二氧化碳，二氧化碳遇水形成碳酸，而硼氫化鉀遇無(wú)機(jī)酸則分解放出氫氣，導(dǎo)致硼氫化鉀還原效率大幅降低，并且產(chǎn)生大量氣泡，離心管在高速離心時(shí)會(huì)發(fā)生炸裂，因此可使用硼氫化鉀粉末還原孔雀石綠后測(cè)定隱性孔雀石綠總量。

3 結(jié)論

以乙腈為溶劑快速提取淡水魚(yú)中的孔雀石綠和隱性孔雀石綠，無(wú)需加入鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸、乙酸銨等試劑，具有重復(fù)性好的特點(diǎn)；加入酸性氧化鋁粉末進(jìn)行固相分散萃取，無(wú)需加入二氯甲烷液液萃取和進(jìn)行固相萃取操作，能夠有效凈化樣品中的油脂和其他雜質(zhì)，對(duì)孔雀石綠和隱性孔雀石綠的提取率和重復(fù)性?xún)?yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，簡(jiǎn)便快速；此外加入微量硼氫化鉀粉末能夠完全把孔雀石綠轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠，實(shí)現(xiàn)隱性孔雀石綠總量的測(cè)定。此外，硼氫化鉀粉末在乙腈溶劑中不溶，避免使用硼氫化鉀水溶液易緩慢產(chǎn)生氫氣的缺點(diǎn)，適用于樣品高速離心，能夠滿(mǎn)足快速提取的要求。