液相色譜-串聯質譜法測定豬組織中58種獸藥殘留

熊增星，劉青，連琦，張文中，胡文斌*

1.江西省食品檢驗檢測研究院（南昌 330001）；2.上海愛博才思分析儀器貿易有限公司（上海 200233）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨（分析純，德國Merck公司）；試驗用水為GB/T 6682《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水；標準溶液混標（1.0 mg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；實際樣品來源于超市和農貿市場。

1.2 儀器與設備

API 6500+四極桿串聯線性離子阱質譜儀（美國 AB SCIEX公司）；SIL-30 AC 220V高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；IKA T18數顯型高速分散機（德國IKA公司）；HITACHI CR22N高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）；N-EVAP112型氮吹濃縮儀（美國Organomatian公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

將多種獸藥混標溶液（1.0 mg/mL）用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的混合標準工作溶液。吸取適量混合標準工作溶液，用基質空白溶液配成質量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL的系列標準工作溶液，臨用現配，所有溶液放置于-18 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取5.00 g樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液，按12 000 r/min均質提取2 min后，在振蕩器上振蕩10 min；按8 000 r/min冷凍離心10 min，轉移上清液于50 mL離心管中，重復提取1次，合并上清液，待凈化。

采用QuEChERS對樣品凈化，取10 mL上清液加入到QuEChERS獸殘凈化小管中，渦旋混勻，按4 000 r/min，離心5 min，取5 mL上清液，于40 ℃氮氣吹干，用1 mL初始流動相溶解，過0.22 μm微孔濾膜，上機測定。此次研究采用空白基質加標樣品比較4種不同凈化方式的凈化效果。

1.3.3 儀器條件

一段時期以來，各地各級公安機關反饋認為，不少公安類警察高校畢業生入警工作后，角色進入慢、適應能力不強，警務一線中所需要的實踐、實戰應用能力存在諸多不足之處。而制約這一問題的主要瓶頸在于警察高校在應用型人才的培養方面尚存短板，尤其是實驗教學管理方面普遍存在不重視、不規范、隨意性大等問題，整體把控意識不強、力度不夠，實驗、實訓教學所必需的較為規范嚴謹的基本管理體系尚未形成乃至實現。

1.3.3.1 液相色譜條件

Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱，柱溫30 ℃；進樣量2 μL；流速0.3 mL/min；流動相A為0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸銨），流動相B為乙腈。梯度洗脫條件：0～1.5 min，99% A；1.5～10 min，99%～70% A；10～18 min，70%～20% A；18～21 min，20%～10% A；21～23 min，99% A。

1.3.3.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）；掃描模式為正離子模式掃描；多反應監測采集方式（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣壓力40 psi；離子源溫度550 ℃；噴霧氣40 psi；輔助加熱氣40 psi；碰撞氣：9 psi；電噴霧電壓5 500 V，質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜和色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

試驗考察Waters C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）對58種獸藥的分離效果。結果發現Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離效果明顯，峰形較好，沒有拖尾現象。混合標準溶液的分離色譜圖見圖1。因此，選擇Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分離柱。

圖1 混合標準溶液的MRM色譜圖（100 ng/mL）

2.1.2 質譜條件優化

以流動注射方式在正離子模式下對58種化合物混標溶液（100.0 ng/mL）進行母離子（Q1）全掃描，確定各目標化合物的母離子，對母離子進行二級質譜掃描（MS2），對去簇電壓、碰撞電壓等參數進行優化，每個化合物選擇2對響應值高的特征離子對作為定量及定性離子對，優化后的質譜參數見表1。液相色譜分離中采用乙腈和0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸銨）作為流動相，通過對梯度洗脫優化，使目標化合物得到較好的分離，混合標準溶液的分離色譜圖見圖1。

表1 58種化合物的多反應監測（MRM）質譜采集參數及基質標準曲線、相關系數、檢出限、定量限

2.2 樣品前處理方法的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

對于豬組織中多類獸藥殘留的同時檢測分析，提取溶劑的選擇最關鍵。在選擇提取溶劑時，要考慮目標物在溶劑中的溶解度、溶劑與基質的浸透效果等因素。常用的提取溶劑有乙腈[7-9]、乙腈水溶液[10-11]、乙酸乙酯[12]、二氯甲烷、甲醇以及水的緩沖鹽[13]。樣品經乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇提取后溶液中油脂含量較多，且雜質去除效果不好，難控制[14]。乙腈是一種極性溶劑，當用其作為提取溶劑時，能夠避免樣品中的脂肪也被過多提取，同時對蛋白質沉淀也起到很好效果。一定比例的水相調整乙腈極性可以同時兼顧多種極性不同的目標化合物。由于凈化步驟選用固相萃取，若水相含量過高，則可能會使目標化合物在固相萃取中被吸附，影響回收率，且后續氮吹濃縮過程也可能會受到影響[15]。綜合多種因素考慮，試驗選擇80%乙腈水溶液作為最佳提取溶劑。

2.2.2 凈化方式的優化

試驗通過空白樣品在5.0 μg/kg水平下加標回收，比較HLB、QuEChERS、PRiMEHLB、正己烷除脂4種凈化方式對豬肉、豬肝、豬肚3種基質中58種化合物回收率的影響，如圖2所示。結果表明：與其他3種凈化方法相比，樣品經QuEChERS凈化后，3種基質回收率在80%～110%的獸藥數量最多，分別為24，44和38種；低于60%或超過120%的獸藥數量相對較少，只有3，1和5種，顯示出較好的回收率效果。HLB凈化方式在豬肝、豬肚基質中的回收率與QuEChERS相當，而在豬肉基質的回收率稍差一些；PRiMEHLB和正己烷除脂凈化方式相對較差。實際試驗中HLB凈化方案操作繁瑣、費時，因此選用QuEChERS凈化。

圖2 不同凈化方式對豬肉、豬肝、豬肚組織中58種獸藥的回收率在各區間的分布

接表1

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線、檢出限和定量限

在優化的提取、凈化和質譜分析條件下，58種化合物在空白樣品基質匹配標準溶液中的濃度（1.0～100.0 ng/mL）與對應的峰面積呈良好的線性關系，相關系數均大于0.99。在基質空白樣品中，添加一定濃度標準溶液，以定量離子3倍信噪比（S/N=3）計算得58種化合物的檢出限分別為0.3～1.5 μg/kg，以定量離子10倍信噪比（S/N=10）得到定量限分別為1.0～5.0 μg/kg，其中紅霉素的檢出限和定量限分別為1.5 μg/kg和5.0 μg/kg，其他57種化合物的檢出限和定量限為0.3 μg/kg和1.0 μg/kg，符合我國對標準曲線、檢出限和定量限的要求，可滿足日常實驗室檢測需求，結果見表1。

2.3.2 回收率與精密度

在1.0，2.0和5.0 μg/kg水平上，進行基質加標回收試驗，考察豬肉基質的回收率和精密度。按照1.3.2處理樣品，各制備6份加標樣品，上機測定，結果見表2。平均加標回收率在63.9%～130.6%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，SRSD，n=6）為0.08%～10.15%，方法準確度和精密度滿足要求。以60%～120%為標準，有83%種化合物的回收率落在合理范圍內，只有少數化合物的回收率小于60%或大于120%，如替硝唑、磺胺嘧啶、惡喹酸、雙氟沙星、差向金霉素、替米考星等。考慮到試驗方法分析的獸藥種類較多，各化合物極性相差較大，對于有少數回收率不好的獸藥，屬于正常現象[16]。對于回收率不太好的獸藥，該方法的檢出限低于我國限量標準，所以即使回收率較差也可以保證檢出率。

表2 豬肉基質樣品中3個濃度下加標回收率及標準偏差（n=6）

接表2

3 結論

試驗建立同時測定豬肉、豬肝、豬肚等組織中58種獸藥殘留量的液相色譜-串聯質譜分析測定方法。比較HLB、QuEChERS、PRiMEHLB、正己烷除脂4種凈化方式對豬肉、豬肝、豬肚3種基質中58種化合物回收率的影響，最終選取QuEChERS為最佳凈化方式。方法僅需1次前處理就可實現對喹諾酮類、大環內酯類、磺胺類、磺胺增效劑、四環素類、硝基咪唑類、林克胺類、抗病毒類八類獸藥殘留檢測。與國標中按化合物類別分別檢測的方式相比，該方法不僅操作簡便、檢驗過程速度快、結果可靠，還節約大量有機試劑，減少人力和時間成本，提高檢測效率。該方法在養豬企業、豬肉類生產加工企業、市場監管等部門使用中具有廣闊的前景。