液相色譜—質譜法檢測食品和飼料中黃曲霉毒素研究進展

趙勝男*，高海軍，劉瑩，戴冠蘋，彭星星，曹晶晶

河南省糧油飼料產品質量監督檢驗中心（鄭州 450004）

黃曲霉毒素是由環境中常見的真菌產生的有毒代謝產物。在干旱、溫暖和潮濕的條件下，黃曲霉和寄生曲霉是主要產生黃曲霉毒素的真菌物種[1]。20世紀60年代，土耳其一種名為“X”的疾病致使超過100 000只火雞和其他家禽在英格蘭死亡[2]。這次瘟疫爆發與受污染的飼料息息相關，這使得科學家開始認識黃曲霉毒素并研究其毒性。此后，黃曲霉毒素污染已逐漸被認為會對全球的食品安全與貿易產生威脅[3]。眾所周知，黃曲霉毒素會污染田間和貯藏作物。通常情況下，食用谷物、花生、奶制品等食品容易受黃曲霉毒素侵害，這是因為當前的農業和食品加工技術無法完全去除黃曲霉毒素。黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1、G2和M1，羥化代謝產物B1可通過膳食對人類和動物的健康構成嚴重威脅。黃曲霉毒素的毒性是毋庸置疑的。據國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）報道，黃曲霉毒素會使人體肝臟致癌。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2被歸類為人類致癌物，而B1是最強有力的致癌物質。世界各地政府均將黃曲霉毒素列入監管范圍，并規定了不同食品中的限量[4]。

為確保食用和流通的食品和飼料安全，研究適用于監管黃曲霉毒素含量的分析方法是至關重要的。完善的分析黃曲霉毒素的方法是基于對目標分析物（包括極性、溶解性、熱穩定性等）、食品成分（如脂肪、水和糖含量）、提取條件、樣品純化以及儀器設備的全面理解。圖1展示了黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的結構式和主要化學性質。黃曲霉毒素檢測技術的發展離不開其自身固有的化學特性。例如，質譜分析通常依靠其分子離子和特定結構片段。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的結構式和主要化學性質

通過回顧比較不同的液質檢測技術并評估其潛力和局限性，我們可以總結促進黃曲霉毒素分析方法發展的關鍵技術、目前需要解決的問題以及未來的研究方向。文章不僅概括了各種食品（包括谷物、花生、香料和乳制品等）和飼料中黃曲霉毒素的液質檢測技術，而且闡明了當前應該解決的問題，并預測了未來檢測技術的發展方向，以期為黃曲霉毒素分析研究提供依據。

1 液相色譜和質譜聯用技術

20世紀80年代以來，液相色譜和質譜聯用技術（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）已經成為真菌毒素檢測發展最快的一項技術?；贚C分離和目標物質荷比（m/z），LC-MS可同時分析多種毒素，優勢明顯。相對于紫外、可見光吸收或者熒光發射，m/z基于目標分析物的分子量是更可靠的定性依據。目前，LC-MS分析靈敏度高，可特異性識別多種毒素，成為真菌毒素分析的首選技術。

1.1 定性

早期LC-MS分析真菌毒素常采用LC和熱噴霧MS聯用。作為一種軟電離技術，熱噴霧MS基于分子離子識別黃曲霉毒素，這項技術與LC保留時間結合，可作為一種定性的有用工具。Holcomb[5]采用熱噴霧MS研究了衍生化黃曲霉毒素B1、B2的結構式和分子量，用碘試劑確定了柱后化學衍生的機理，碘試劑已被廣泛用于液相色譜熒光檢測（liquid chromatographyfluorescence detection，LC-FLD）分析中增強黃曲霉毒素B1、G1熒光發射。Cappiello[6]采用電子轟擊電離質譜（EI-MS）分析毒素，黃曲霉毒素通過反相毛細管柱進入離子源，結果表明全掃描模式可用于定性目標離子，選擇離子掃描（selected ion monitor，SIM）模式適用于定量分析，檢出限大約10 ng/mL，靈敏度較高。

盡管早期LC-MS分析食品中黃曲霉毒素靈敏度不夠高，但作為定性工具特異識別性較高。最初，通過生物認證定性黃曲霉毒素[7]，這種方法間接、耗時，迅速被基于黃曲霉毒素物理化學特性的新技術取代（例如薄層色譜、化學衍生和熒光檢測）[8]，目前，包括氣相色譜質譜聯用（Gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）、LC-MS在內的質譜檢測技術廣泛用于特異性識別黃曲霉毒素[9]。

1.2 定量

20世紀90年代后期，由于靈敏度較高，LC-MS尤其是液相三重四級桿質譜聯用（LC-triple quadrupole，LC-QQQ）已被廣泛用于食品中不同有機化學物的定量分析。盡管LC-MS花費高，研究者也嘗試用這項技術來定量分析黃曲霉毒素。研究表明，受樣品基質成分影響，LC-MS分析黃曲霉毒素時信號明顯降低[10]，這主要是黃曲霉毒素不完全電離造成的，我們可通過稀釋基質濃度、純化、加標或者使用內標例如13C標記黃曲霉毒素來減少基質影響[11]。稀釋是一種簡單的降低基質影響的方法，但對LC-MS靈敏度要求較高。例如，牛奶中黃曲霉毒素質量濃度0.5 ng/mL，如果稀釋10倍可消除基質影響，LC-MS本身必須可定量低于0.05 ng/mL黃曲霉毒素，以此類推，如果樣品中黃曲霉毒素濃度更低，對LC-MS靈敏度要求更高。如果大部分商品化LC-MS靈敏度無法滿足試驗要求，就需要加標或者純化步驟來檢測較低濃度的黃曲霉毒素。樣品純化常被用于實驗室消除基質干擾，但是步驟繁瑣，甚至采用免疫親和柱，LC-MS分析也不能免于基質影響。采用基質標準校正可得到滿意的定量結果，此法需加標黃曲霉毒素到干凈基質用作標準校正，并假設標準校正和樣品中的基質對黃曲霉毒素有相似的影響，但是準備基質標準校正比較復雜，尤其當研究者需處理多種食品基質[12]。加標是定量最直接的方法，但是分析一個樣品中四種不同濃度的黃曲霉毒素，加標法有一定困難。同位素稀釋試驗（stable isotope dilution assay，SIDA）是一種較為理想的減少基質干擾的方法，此法采用13C作為內標可定量黃曲霉毒素。

Vahl等[13]研究了LC-MS法檢測食品中四種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，此法采用黃曲霉毒素M1作為內標物，即用甲醇提取，柱層析法純化，在無花果、花生醬、花生、辣椒、胡椒和咖喱中加標2 ng/mL黃曲霉毒素回收率在40%～270%之間，這主要是由于樣品純化方法對消除基質干擾效果不佳。Cavaliere等[14]同樣采用黃曲霉毒素M1作為內標物檢測了谷物中的黃曲霉毒素，用乙腈-水（80∶20，V/V）作為提取液，稀釋后用固相萃取（SPE）純化，LC-MS/MS上機檢測，基質標準校正定量，回收率在81%～101%之間變化，相對標準偏差（SRSD）小于12%，方法檢出限（SLOD）在0.1～0.6 ng/mL之間。采用內標法是一個很好的方法，但關鍵是選擇合適的內標物或者基質標準校正溶液，否則將難以降低定量時的基質干擾。

Cervino等[15]合成了氘代黃曲霉毒素B2、G2用于補償提取過程和基質干擾中分析物的損失，這兩種氘代內標在提取前加入樣品中（杏仁、小麥粉），結果顯示回收率、精密度較高，四種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2回收率變化在90%～105%之間，變異系數（coefficient of variation，CV）分別是3.6%，4.8%，12%和14%。氘代黃曲霉毒素B2、G2由于相似的物化性質更適用于定量黃曲霉毒素B2、G2。Li等[16]研究了同位素稀釋LC-MS法檢測飼料中的黃曲霉毒素，用甲醇-水（70∶30，V/V）或者乙腈-水（84∶16，V/V）作為提取液，過濾稀釋，上機前向提取物中加標13C—黃曲霉毒素B1，在C18色譜柱上（2.1 mm×50 mm，1.7 mm）分離，三重四級桿MS上分析，通過比較標品和樣品的保留時間及相對離子比率來定性黃曲霉毒素，日內回收率變化在78%～122%之間。此外，Breidbach等[17]采用二維液相色譜（2D-LC）和雙同位素稀釋法研究了一種準確檢測黃曲霉毒素B1方法，黃曲霉毒素B1和基質成分成功分離，13C作為內標物質降低了基質效應，采用此法檢測谷物嬰兒食品、玉米和玉米類飼料中黃曲霉毒素B1的誤差為8.9%。Campone等[18]報道了采用2D-LC-MS分析檢測啤酒中的黃曲霉毒素、赫曲霉毒素A和伏馬菌素B1、B2，2D-LC消除了伏馬菌素和赫曲霉毒素洗脫時殘留的干擾物質，同樣采用基質標準校正定量。

1.3 檢測通量

對研究者來說，如何監控多種真菌毒素污染是一個挑戰。當需要分析多種真菌毒素時，由于LC-MS可同時定性定量多種毒素，成為首選的技術。例如，Zhang等[19]比較了LC-MS和LC-FLD兩種技術分析檢測零售超市嬰兒食品中的真菌毒素，研究表明采用LCFLD技術，需使用多種方法逐一分析各種真菌毒素，而采用LC-MS技術只需一種通用方法即可分析多種毒素。當前重點是充分利用LC-MS的分析通量，研究出多種真菌毒素的檢測方法。目前，已經研究出許多LC-MS分析多種毒素方法，包括從樣品中提取毒素、純化、上機檢測，LC-QQQ-MS已經實現連續檢測500多種真菌毒素[20]，研究者分析大量毒素時，需要利用不同分析物的物理化學特性找到合適的提取和樣品純化方法。

Spanjer等[21]提取了不同食品中（花生、開心果、小麥、玉米、玉米片、葡萄干和無花果）包括黃曲霉毒素在內的33種真菌毒素，用乙腈-水（80∶20，V/V）和甲醇-水（70∶30，V/V）作為提取液，稀釋后上機LC-MS/MS分析，采用基質標準校正定量，這比使用SPE或者免疫親和柱純化更簡化。Mol等[22]提出采用一種常規提取法分析食品和飼料中的136種農藥、36種毒素（包括黃曲霉毒素）和86種獸藥，水-乙腈-1%甲酸作為提取液，提取后無需純化，直接上機LC-QQQ，大部分分析物回收率在70%～120%之間，SRSD＜10%，并通過基質標準校正和減少進樣體積（5 mL）降低基質干擾。目前，基于LC-MS分析多種毒素的方法可明顯改善分離效率，未來將取代許多單一毒素的分析方法[23]。另外，檢測多種真菌毒素的方法需要平衡檢測結果和分析通量。例如，Zhang等[24]提出了一種分析食品中多種毒素的同位素稀釋LC-MS/MS法，包括黃曲霉毒素、伏馬菌素、赫曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、HT-2/T-2毒素和玉米赤霉烯酮等，每種毒素用13C內標，可分析花生醬、小麥粉和玉米中濃度在1～1 000 ng/g的毒素，總體回收率在80%～120%之間，SRSD＜20%，超過90%的回收率在90%～110%之間，實驗室內SRSD＜10%，實驗室間SRSD＜15%。盡管這個方法并不能完全定量食品中191種真菌毒素[25]、295種細菌以及真菌代謝物[23]，但可用于篩選不同基質中的毒素。

目前，盡管大部分LC-MS檢測毒素的方法采用LC-QQQ，但液相高分辨率質譜（LC-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）逐漸吸引了研究者關注，包括液相色譜軌道阱高分辨質譜聯用儀（LCOrbitrap-MS）、液相色譜飛行時間質譜儀（LC-Q-time of flight-MS，LC-Q-TOF-MS）等。LC-HRMS可以獲得高分辨率的全掃描數據，盡管應用并未普及，但已在真菌毒素分析領域快速發展，并成為篩選食品和飼料中多種毒素的有力工具。早期LC-HRMS缺少儀器軟件和檢測標準，嚴重阻礙其在毒素檢測領域的發展，但計算機硬件、數據處理、數據存儲系統發展極大促進了LC-HRMS進步步伐。類似于LC-QQQ，LC-HRMS尤其是LC-Orbitrap-MS通常用于多種毒素分析，而LC-Q-TOF用于黃曲霉毒素分析應用較少。Toth等[26]采用LC-Q-TOF研究了黃曲霉毒素在不同的碰撞能量下的分裂模式，但這項研究并未定量。早期關于LC-HRMS研究中，Vaclavik等[27]將實時直接分析（Direct Analysis in Real Time，DART）的電離源和LC-Orbitrap-MS結合定量分析了小麥和玉米中的多種毒素，無需LC分離，通過DART-LC-Orbitrap-MS直接分析樣品提取物，并研究了定性準確率和定量分辨率。對于黃曲霉毒素，LC-QQQ靈敏度高于DART。Lattanzio等[28]采用LC-Orbitrap-MS研究了谷物中包括黃曲霉毒素、伏馬菌素、赫曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等在內的多種毒素，通過分子離子和高能量碰撞分解（High Energy Collision Dissociation，HCD）產生的片段來分析每種毒素，結果顯示靈敏度、回收率和重復性與LC-QQQ方法類似。另外，Castaldo等[29]提出了一種采用LC-Orbitrap-MS將寵物食品中的目標毒素檢測與其他物質篩選相結合的新穎方法，分辨率高、結果準確。

上述代表性研究是為了說明基于LC-MS分析檢測黃曲霉毒素的主要趨勢和挑戰。目前，LC-QQQ已經由分析單一毒素發展為可同時分析多種毒素，而LCHRMS可以兼顧分析目標物和其他物質，這是毒素檢測的新模式。另外，和LC-MS相比，快速檢測法（例如酶聯免疫吸附測定法）和LC-FLD花費較低，檢測精密度和準確度相當[30]，具有一定的競爭力。選擇檢測技術需要考慮多方面因素，不僅僅是定量，如果對毒素分子識別有要求，LC-MS將是首選技術。

2 結論

黃曲霉毒素污染對全球公共衛生領域是一項巨大挑戰，全球貿易、氣候變化和多樣化的監管政策讓問題更復雜，對毒素分析技術手段的需求極大促進了食品和飼料中黃曲霉毒素液質檢測的發展。黃曲霉毒素儀器分析經歷了液相色譜紫外/熒光檢測到液質聯用的過程，從非特異性識別（目視判斷、紫外吸收或熒光發射）到特異性識別（質荷比、離子比、分子碎片），傳統的單一毒素檢測已經被同時分析多種毒素替代。目前，液質檢測技術發展最快，包括樣品提取、純化和上機檢測在內，每一步均扮演著關鍵角色，雖然定性定量結果較為滿意，但多種復雜樣品前處理耗時繁瑣，檢測成本、對人員檢驗技能要求較高，未來高效的前處理技術、降低成本將成為研究重點，同時在特異性識別、靈敏度和檢測通量方面有突破的新技術將繼續成為研究熱點。