超聲輔助檸檬酸法優化草魚魚鱗脫鈣工藝

郝星海，張崢，夏牧秋，石夢瑤，秦紀寧，丁云橋*

齊魯工業大學（山東省科學院）化學與化工學院（濟南 250353）

漁業生產的水產品加工過程中會產生大量下角料，若不進行妥善處理，會對環境造成不良影響[1]。魚鱗是水產品加工過程中主要廢料之一，研究分析表明其內含有豐富的礦物質和蛋白質，蛋白質含量占魚鱗總質量的一半以上，其中以膠原蛋白含量最為豐富[2]。魚鱗膠原來源廣泛，魚鱗中提取膠原不僅能減少環境污染，還能解決口蹄疫、瘋牛病等帶來的膠原蛋白安全性問題。將魚鱗“變廢為寶、重新利用”不僅可以避免發生安全性問題，還可以提升魚產品的附加值[3-5]。

近年來，國內學者對鰱魚、鳙魚、羅非魚等進行膠原提取脫鈣工藝的優化[6-8]，對草魚魚鱗脫鈣工藝的研究相對較少。草魚作為淡水魚中的“四大家魚”之一，人工養殖多，繁殖快[9]，魚鱗約占魚體比重2.5%，其中含有豐富的膠原蛋白，可作為膠原提取的重要原料，且易獲價廉[10-12]。

魚鱗中含有大量礦物質，如磷酸鹽、碳酸鹽、羥基磷灰石等，以羥基磷灰石占比最高，且與膠原蛋白粘附緊密，難以分離，這極大影響了膠原蛋白提取率[10]。所以，脫鈣工藝的優化成為魚鱗膠原提取的關鍵。常見魚鱗脫鈣方法有酸法和螯合法[13-14]。螯合劑EDTA價格昂貴，不適用于大規模的工業生產，而鹽酸作為一種強酸，會使一部分膠原蛋白流出，造成損失，導致其經濟效益的降低[15]。

采用弱酸檸檬酸為脫鈣劑，結合超聲波的空化作用，在液體中產生巨大的壓力迫使鈣離子溶出，縮短脫鈣時間，提高脫鈣效率。在單因素試驗的基礎上進行L9(34)正交試驗，在確保膠原蛋白低損耗的情況下，確定最佳脫鈣工藝。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

草魚魚鱗（收集于濟南市市中區海鮮大市場，清洗干凈，晾干備用）。

氯化鈣（天津市登科化學試劑有限公司）；對二甲氨基苯甲醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氨水、氯化銨、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、硫酸、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；L-羥基脯氨酸（純度99%）、鉻黑T、氯胺T（上海麥克林生化科技有限公司）；所用試劑均為分析純。

BSA124S賽多利斯高精度分析天平（上海錫為科學儀器有限公司）；雷磁PHSJ-4A實驗室pH計（上海儀電科學股份有限公司）；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2600紫外-可見近紅外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗設計

1.2.1.1 超聲時間對脫鈣率的影響

準確稱取1.00 g魚鱗，置于50 mL燒杯中，控制檸檬酸質量分數3%、料液比1∶20 g/mL、超聲功率為200 W。在上述條件下，探究超聲時間（30，40，50，60，70，80和90 min）對脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評價指標。

1.2.1.2 檸檬酸質量分數對脫鈣率的影響

準確稱取1.00 g魚鱗，置于50 mL燒杯中，控制超聲時間1 h、料液比1∶20 g/mL、超聲功率為200 W。在上述條件下，探究檸檬酸質量分數（3%，4%，5%，6%，7%，8%和9%）對脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評價指標。

1.2.1.3 料液比對脫鈣率的影響

準確稱取1.00 g魚鱗，置于50 mL燒杯中，控制超聲時間1 h、檸檬酸質量分數3%、超聲功率為200 W。在上述條件下，探究料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40 g/mL）對脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評價指標。

1.2.1.4 超聲功率對脫鈣率的影響

準確稱取1.00 g魚鱗，置于50 mL燒杯中，控制超聲時間1 h、檸檬酸質量分數3%、料液比1∶20 g/mL。在上述條件下，探究超聲功率（100，125，150，175，200，225和250 W）對脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評價指標。

1.2.2 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，選取最優值及最優值兩側數值作為3個水平，選擇超聲時間（A）、檸檬酸質量分數（B）、料液比（C）、超聲功率（D）為4個影響因素進行L9(34)進行正交試驗。試驗因素與水平如表1所示。

1.2.3 脫鈣率的測定

1.2.3.1 鈣離子標準曲線的繪制

根據蔣柏泉等[16]的方法略做修改，將滴定時補充蒸餾水總體積改為50.0 mL。稱取一定量烘干至恒重的無水氯化鈣，配制成2 mg/mL的氯化鈣標準溶液，分別取0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0 mL鈣離子標準液于150.0 mL錐形瓶中，每瓶內準確補充蒸餾水至總體積50.0 mL，隨后加入5.00 mL氨水-氯化銨緩沖液（pH 10）和3滴鉻黑T指示劑，搖勻后用0.01 mol/L的EDTA標準溶液滴定。溶液由酒紅色變為藍色時為滴定終點，記錄EDTA消耗體積，平行滴定3次，取平均值。分別以EDTA滴定消耗體積為橫坐標，鈣離子質量濃度為縱坐標繪制鈣離子的標準曲線，得到該曲線的線性回歸方程。

1.2.3.2 魚鱗中總鈣含量的測定

將魚鱗先后放入5% NaCl溶液、0.5 mol/L的Na2CO3溶液中，在一定磁力轉速下攪拌12 h，除去魚鱗表面的脂質，晾干后備用。將預處理好的魚鱗準確稱取3.00 g，按料液比1∶20加入1 mol/L鹽酸溶液中，并在室溫下磁力攪拌24 h。處理完成后將液體轉移至100 mL容量瓶定容，用0.01 mol/L EDTA溶液進行滴定并計算出鈣離子含量，按式（1）計算。

式中：T為由標準曲線所得鈣離子質量濃度，mg/mL；V1為加入鹽酸的體積，mL；D為稀釋倍數；M為魚鱗總質量，g。

1.2.3.3 脫鈣液中鈣含量的測定

取1.00 mL脫鈣液，準確補充蒸餾水至總體積50 mL，加入5.00 mL氨水-氯化銨緩沖溶液（pH 10）和3滴鉻黑T指示劑。搖晃均勻后用0.01 mol/L的EDTA標準溶液滴定，當溶液由酒紅色變為藍色時達滴定終點。通過鈣離子標準曲線得出脫鈣液中鈣離子的含量，按式（2）計算。

式中：T為由標準曲線所得鈣離子質量濃度，mg/mL；V2為加入檸檬酸的體積，mL；D為稀釋倍數；M為魚鱗總質量，g。

1.2.3.4 脫鈣率的計算

依據脫鈣液中總的鈣離子含量比上魚鱗中總的鈣離子含量，所得數值即為脫鈣率C，按式（3）計算。

式中：A為脫鈣液中鈣離子含量，%；B為魚鱗中總鈣離子含量，%。

1.2.4 羥脯氨酸溶出率的測定[17]

1.2.4.1 氯胺T溶液及顯色劑的配制

稱取2.6 g一水檸檬酸、1.4 g氫氧化鈉、7.8 g無水乙酸鈉配制成pH=6.8的緩沖溶液，加入25 mL的異丙醇，用水定容至100 mL。用上述緩沖溶液溶解1.41 g的氯胺T，配制成氯胺T溶液，此溶液臨用前現配。

稱取5.0 g對二甲氨基苯甲醛，用17.5 mL質量分數60%的高氯酸溶解，緩慢加入32.5 mL異丙醇，冷卻至室溫備用。溶液臨用前現配。

1.2.4.2 羥脯氨酸標準曲線的繪制

準確稱取50 mg羥脯氨酸，用水溶解并加入1滴硫酸溶液（3 mol/L）定容至100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的羥脯氨酸標準儲備液。

移取5 mL上述標準儲備液至500 mL容量瓶中，用水定容。分別移取上述溶液5，10，15，20和25 mL于50 mL容量瓶中，用水定容，得到不同濃度的羥脯氨酸標準溶液。

移取4 mL上述溶液于試管中，加入2 mL氯胺T試劑，混合后在室溫下放置20 min。加入2 mL顯色劑，充分混合后用不透明的塑料薄膜封口，迅速放入60 ℃水浴鍋中加熱20 min，取出后用流動水沖洗3 min，在室溫下放置30 min，于558 nm處進行吸光度測定。每組試樣重復測定3次，取平均值后，以羥脯氨酸的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，用Excel繪制羥脯氨酸標準曲線。

1.2.4.3 魚鱗中羥脯氨酸含量的測定

稱取1.00 g魚鱗，取30 mL 3 mol/L的硫酸于50 mL燒杯中，在105 ℃干燥箱內水解16 h，取出稀釋一定倍數后，進行顯色反應和吸光度測定，方法同1.2.4.2。根據式（4）計算出脫鈣液中羥脯氨酸含量。

式中：T’為由標準曲線所得羥脯氨酸質量濃度，μg/mL；V3為加入硫酸體積，mL；D為稀釋倍數；M為魚鱗總質量，g。

1.2.4.4 脫鈣液中羥脯氨酸含量的測定

取一定量脫鈣液稀釋一定倍數后，進行顯色反應和吸光度測定，方法同1.2.4.2小節。根據式（5）計算出脫鈣液中羥脯氨酸含量。

式中：T’為滴定后由標準曲線所得羥脯氨酸質量濃度，μg/mL；V4為脫鈣液體積，mL；D為稀釋倍數；M為魚鱗總質量，g。

1.2.4.5 羥脯氨酸溶出率的計算

依據脫鈣液中總的羥脯氨酸含量比魚鱗中總的羥脯氨酸含量，所得數值即為羥脯氨酸溶出率，按式（6）計算。

式中：Y為脫鈣液中羥脯氨酸含量，%；X為魚鱗中總羥脯氨酸含量，%。

2 結果與分析

2.1 鈣離子標準曲線的繪制

鈣離子濃度和EDTA的體積關系如圖1所示。鈣離子的標準曲線為y=0.009 6x+0.000 7，R2=0.999 8，表明鈣離子濃度與滴定所用的EDTA體積間具有良好線性關系。

圖1 鈣離子標準曲線

2.2 羥脯氨酸標準曲線的繪制

羥脯氨酸濃度和吸光度關系如圖2所示。羥脯氨酸的標準曲線為y=0.175 2x+0.007 7，R2=0.997 5，表明吸光度與羥脯氨酸濃度間有較好線性關系。

圖2 羥脯氨酸標準曲線

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 超聲時間對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

超聲時間對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見圖3。隨著超聲時間增加，鈣離子與檸檬酸分子接觸時間增加，脫鈣率緩慢增長，在70 min時達到最大值90.4%，隨后緩慢下降。隨著超聲時間的增加，羥脯氨酸的溶出率始終低于1.68%。說明在70 min條件下，魚鱗的脫鈣效果好，且膠原蛋白損失量少。

圖3 超聲時間對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.3.2 檸檬酸質量分數對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

檸檬酸質量分數對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見圖4。隨著檸檬酸質量分數增加，脫鈣率緩慢增長，在6%時達到最大值，之后隨濃度增大而緩慢下降。提升反應濃度有利于鈣離子與檸檬酸分子反應促進脫鈣。隨著檸檬酸濃度增加，羥脯氨酸的溶出率一直低于1.29%，膠原蛋白的損失量少。說明在檸檬酸質量分數6%的條件下，魚鱗的脫鈣效果較好。

圖4 檸檬酸質量分數對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.3.3 料液比對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

料液比對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見圖5。提取液體積對脫鈣率的影響較大，料液比1∶10和1∶15 g/mL時，脫鈣效果非常不理想。隨著料液比增加，脫鈣率逐漸增長，在1∶25 g/mL時出現最大值，繼續增大料液比后緩慢下降。原因可能是在脫鈣液濃度不變的情況下，隨著體積增加，魚鱗與脫鈣液接觸面積增大，料液比增加至1∶25 g/mL時，魚鱗中的鈣離子已與檸檬酸分子充分結合，脫鈣率不再隨脫鈣液體積的增加而上升。隨著料液比增加，羥脯氨酸溶出率一直低于4.11%。說明在料液比1∶25 g/mL條件下，魚鱗的脫鈣效果較好，且膠原蛋白的損失量較少。

圖5 料液比對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.3.4 超聲功率對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

超聲功率對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見圖6。隨著超聲功率增加，脫鈣率緩慢增長，而在175～200 W間出現較大漲幅，猜想可能是超聲能轉化為熱能促進脫鈣，還可能是由于超聲波的空化作用，加速了魚鱗中的鈣離子進入到脫鈣液中，提升了脫鈣率，在達到200 W最大值后緩慢下降。隨著超聲功率的增加，羥脯氨酸的溶出率一直低于1.75%，說明在超聲功率200 W條件下，魚鱗的脫鈣效果較好，且膠原蛋白的損失量較少。

圖6 超聲功率對脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.4 正交試驗設計分析

根據單因素試驗結果，選取超聲時間60，70和80 min，檸檬酸質量分數5%，6%和7%，料液比1∶25，1∶30和1∶35 g/mL，超聲功率175，200和225 W進行正交試驗，設計L9(34)正交試驗表（見表2）進行試驗。由正交試驗表中極差R可知，影響魚鱗脫鈣率的因素主次順序為A＞C＞D＞B，即超聲時間＞料液比＞超聲功率＞檸檬酸質量分數。

利用IBM SPSS 26.0進行方差分析，結果見表3。試驗中各因素對草魚魚鱗脫鈣率均有影響，其中時間因素影響顯著（p＜0.05），即超聲時間是決定脫鈣率的關鍵性因素。p值越小顯著性越強，影響越顯著。由正交試驗方差分析可知，pA＜pC＜pD＜pB，影響魚鱗脫鈣率的因素主次順序為A＞C＞D＞B，即超聲時間＞料液比＞超聲功率＞檸檬酸質量分數，與極差的分析結果一致。

表3 正交試驗方差分析表

由表2可知，理論最優為A3B1C3D3，在此條件下試驗得脫鈣率為92.7%，低于正交表中第7組數值93.8%。綜合考慮影響魚鱗脫鈣的因素水平，選取最優參數組合A3B1C2D2，即超聲時間80 min、檸檬酸質量分數5%、料液比1∶25 g/mL、超聲功率200 W。此條件在正交試驗表的第7組出現，測定脫鈣率為93.8%。

表2 L9(34)正交試驗結果

3 結論

試驗采用超聲波輔助檸檬酸的方法對草魚魚鱗脫鈣工藝進行優化。用單因素試驗探究超聲時間、檸檬酸質量分數、料液比、超聲功率對魚鱗脫鈣的影響，經正交試驗選取最佳脫鈣工藝。經正交試驗極差及方差分析可知，決定脫鈣率的4個因素的影響順序為超聲時間＞料液比＞超聲功率＞檸檬酸質量分數。最佳脫鈣工藝條件為超聲時間80 min、檸檬酸質量分數5%、料液比1∶25 g/mL、超聲功率200 W時，脫鈣率可達93.8%，而羥脯氨酸的溶出率僅1.38%，證明超聲輔助檸檬酸脫鈣效果影響顯著。優化后的工藝脫鈣用時較短，膠原蛋白損耗量少，可應用于實際生產。試驗結果為草魚魚鱗脫鈣工藝提供明確的試驗參數，也為魚鱗膠原蛋白的提取規?；a提供良好技術參考。