響應面法優化香榧假種皮黃酮提取及活性研究

孫千雅，毛依依，孫熔茹，戴妙燁，周文潔，孫小紅*

紹興文理學院元培學院（紹興 312000）

香榧（Torreya grandis）為紅豆杉科榧樹屬常綠喬木，是人工選擇培育的優良品種，有耐寒、喜光、好濕潤的特性[1]，主要集中我國南方濕潤區，諸如浙江諸暨、嵊州等地。香榧假種皮為香榧外層厚肉質化部分，質量占比可達鮮重的50%～60%，作為香榧加工后的殘余廢料，多因無高效處理方式而造成腐爛污染。研究發現香榧假種皮富含二萜類、揮發油、黃酮類等生物活性成分[2-3]，對其中的醇、醛、烯等20多種芳香成分適當提取后，可用于高級精油的制作[4-6]。所提取的植物黃酮具有明顯的抗氧化、鎮痛、抗癌等作用[7-8]，并在醫藥、食品和日用化工等領域有廣闊市場前景[9-10]。張露等[11]首次比較香榧各不同部位提取物成分的差異，其中黃酮成分在香榧假種皮和香榧莖中的含量最高。

植物黃酮常用提取方法有水提取法、醇提取法、微波提取法、超聲波輔助提取法及超臨界流體萃取法（SFE）。試驗以乙醇為主要溶劑，采用超聲波輔助溶劑法提取香榧假種皮中的黃酮。設計相應的單因素試驗，應用響應面法綜合分析，對提取工藝條件進行優化，并測定香榧假種皮總黃酮的體外活性，從而為香榧假種皮黃酮的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧假種皮（2020年10月采自浙江嵊州香榧產區）；蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH、ABTS（上海麥克林生化科技有限公司）；α-葡萄糖苷酶（上海藍季科技發展有限公司）；α-淀粉酶（邢臺萬達生物科技有限公司）；PNPG（南京都來生物有限公司）；其他試劑均為分析純AR。

1.2 儀器與設備

HH-2數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；800Y高速多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；SK2200H超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；722N可見分光光度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；JA2003電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定黃酮類化合物，將吸光度A設為縱坐標，濃度C設為橫坐標來繪制標準曲線[12]。標準曲線方程為A=9.75C-0.002 6（R2=0.999）。

1.3.2 總黃酮得率的測定

參照1.3.1中的蘆丁標準曲線來測定香榧假種皮中總黃酮得率，按式（1）計算。

式中：C為1.3.1中得出的標準曲線上查出的質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；M為稱取的香榧假種皮粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

為初步了解各因素對黃酮得率的影響，分別選用超聲功率（160，240，320，400，480和560 W）、超聲時間（20，30，40，50，60和70 min）、液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1和70∶1 mL/g）、乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%，80%和90%）進行單因素試驗。

1.3.4 響應面分析法試驗設計

根據BBD試驗的設計原理，采用溫度60 ℃，超聲功率、超聲時間、液料比、乙醇體積分數為自變量，總黃酮得率為指標，制定相關因素的發展水平表，可見表1。

表1 響應面因素與水平

1.3.5 體外抗氧化活性試驗與體外降血糖試驗

香榧假種皮中的總黃酮對DPPH、ABTS自由基的清除作用，分別參考胡衛成等[13]的測定方法及秦晶晶等[14]的測定方法。對抑制α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶活性的測定，分別參考姚志仁等[15]和李勝華等[16]的測定方法。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果與分析

由圖1可知，總黃酮提取率于480 W時出現最高值，以480 W為分界，前段呈上升趨勢，后段呈下降趨勢，推測得率下降原因可能是超聲過度破壞黃酮結構，因此選擇超聲功率480 W進行黃酮提取試驗。

圖1 超聲功率對總黃酮得率的影響

由圖2可知，總黃酮提取率于30 min時出現最大值，以30 min為分界，前段呈上升趨勢，后段呈下降趨勢。推測得率下降原因可能也是過度超聲破壞黃酮結構，為保證黃酮提取率及減少提取時間，選擇超聲時間30 min進行黃酮提取試驗。

圖2 超聲時間對總黃酮得率的影響

由圖3可知，液料比60∶1（mL/g）時總黃酮得率出現最大值，但為減小過濾時間及減少溶劑浪費，選擇液料比40∶1（mL/g）進行黃酮提取試驗。

圖3 液料比對總黃酮得率的影響

由圖4可知，總黃酮提取率于60%乙醇體積分數出現最大值，以乙醇體積分數60%為分界，前段呈上升趨勢，后段呈下降趨勢。提取率下降原因是乙醇體積分數過高時，極性減小，導致親脂性的部分成分溶解，黃酮類物質競爭性結合乙醇-水分子[17]。因此，選擇乙醇體積分數60%進行黃酮的提取試驗。

圖4 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面結果分析

試驗響應面的設計與結果見表2，數據方差分析及顯著性檢驗見表3。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 響應面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

將4個單因素與響應值Y通過Design Expert v8.0軟件進行回歸擬合，可得到總黃酮得率（Y）的多元二次回歸擬合方程：Y=-110.221 25+0.019 577A+0.770 60B+0.995 47C+3.046 45D+6.000 00×10-4AB-8.812 50×10-4AC-1.968 75×10-4AD-2.500 00×10-5BC-7.800 00×10-3BD+8.700 00×10-3CD+2.122 40×10-6A2-0.010 114B2-0.012 764C2-0.026 214D2

2.2.2 響應曲面分析

從表3可知，模型F值為3.14，p值=0.020 2（＜0.05），說明該模型水平差異顯著，失擬項p=0.100 5（＞0.05），說明該模型失擬項差異不顯著，具有較高擬合度。二次項（C）p=0.030 4＜0.05，有顯著影響，二次項（D）p=0.000 2＜0.01，有高度顯著影響；交互項對回歸模型影響不顯著。4個因素的作用強度由強至弱，依次為乙醇體積分數＞液料比＞超聲功率＞超聲時間。

由于試驗中各因素間存在兩兩相互作用以及最佳參數與各參數間的交互作用，可得到以響應面圖形的響應值為結果的曲面圖[18-20]。根據表3的結果進行多元回歸擬合發現4個因素對香榧假種皮總黃酮得率不僅是簡單的線性關系，而是兩兩因素交互作用產生的差異現象。

據圖5可知，BD、CD的等高線圖形均呈橢圓狀，說明其相互作用顯著。而BC的等高線圖形更趨于圓形，說明其相互作用并不顯著。B的響應面較陡峭，C次之，A與D較平緩。由此可說明，乙醇體積分數為影響總黃酮提取的最顯著因素，液料比為次顯著因素，超聲功率與超聲時間也均為影響因素。

圖5 響應面和等高線圖

2.2.3 最優工藝條件的確定及模型驗證

通過Design Expert v8.0軟件對回歸方程進行推算，理論最佳工藝條件為超聲功率409.74 W、超聲時間25.75 min、液料比45.88∶1（mL/g）、乙醇體積分數59.86%。在此最優條件下得總黃酮得率為15.30 mg/g。鑒于試驗操作合理性，將工藝調整為超聲功率400 W、超聲時間25 min、液料比45∶1（mL/g）、乙醇體積分數60%。為驗證試驗結果的可靠性，采用優化后的工藝參數進行3次重復試驗，實際總黃酮得率為14.51 mg/g，與預測結果相近，證實試驗采用優化所得提取工藝條件準確。

2.3 總黃酮體外抗氧化試驗分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

由圖6可知，在一定范圍內，VC對DPPH自由基的清除能力始終處于較高水準，而總黃酮和BHT清除DPPH自由基的能力隨著自身濃度增加而先增強后趨于平緩。3種物質對清除DPPH自由基的綜合能力為VC＞BHT＞總黃酮。質量分數0.125 mg/g時，香榧總黃酮最大清除率可達69.43%。

圖6 香榧假種皮總黃酮對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定

由圖7可知，在一定范圍內，VC、BHT和總黃酮對ABTS自由基的清除能力均隨著濃度增加而遞增，在0.125～0.150 mg/g范圍內，VC、總黃酮的清除能力慢慢趨向平緩。3種物質對清除ABTS自由基的綜合能力為VC＞總黃酮＞BHT。質量分數0.150 mg/g時，香榧總黃酮可達到最大清除率99.85%。

圖7 香榧假種皮總黃酮對ABTS自由基的清除作用

2.4 總黃酮體外降血糖試驗分析

2.4.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性測定

由圖8可見，在一定范圍內，阿卡波糖和總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用都隨著濃度增加而遞增，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率上升速度略快于總黃酮。試驗可證明阿卡波糖和總黃酮均對α-葡萄糖苷酶具有較好抑制作用，其抑制活性具有明顯劑量依賴性。兩者對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為阿卡波糖＞總黃酮。質量分數200 mg/g時，香榧總黃酮可達最大抑制率38.20%。

圖8 黃酮對α-葡萄糖苷酶活性的抑制

2.4.2 抑制α-淀粉酶活性測定

由圖9可知，在一定范圍內，阿卡波糖、總黃酮和蘆丁對α-淀粉酶的抑制活性都隨濃度增加而呈上升趨勢，其中總黃酮抑制率略高于蘆丁抑制率，但遠低于阿卡波糖的抑制率。質量分數2.0 mg/g時，香榧總黃酮可達到最大抑制率28.07%。

圖9 黃酮對α-淀粉酶活性的抑制

3 結論

試驗采用Box-Behnken響應面分析法優化香榧假種皮總黃酮提取工藝，得出最優條件：超聲功率409.74 W、超聲時間25.75 min、液料比45.88∶1（mL/g）、乙醇體積分數59.86%，總黃酮得率最高為15.30 mg/g。根據體外抗氧化活性與降血糖試驗得出結論：香榧假種皮總黃酮對DPPH、ABTS有較好清除能力，對抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性較好。