羌活勝濕湯治療強直性脊柱炎的網絡藥理學分析*

許曉娜，許二平，王曉鴿，2

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)屬于風濕免疫系統疾病，患者主要是青壯年男性[1]，可引起繼發性骨量減少甚至骨質疏松[2]，亞洲國家發病率為1.67%[3]，其中我國發病率約為0.2%～0.4%[4]。雖然AS的發病率不是很高，但此病有致畸的可能性[5]，須引起重視。強直性脊柱炎的病因病機尚未完全闡明，多認為與遺傳因素和環境因素相關。研究發現，HLA-B27、MHC、IL23R、ERAP1、KIF12B、RUNX3、TNF等為AS的遺傳易感基因[6-12]，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、白細胞介素-23(interleukin-23，IL-23)/輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)[13]等相關通路與AS的發生發展關系密切。此外，微生物感染也是引起AS的重要原因，目前研究較多的有肺炎克雷伯菌感染[14]、衣原體感染[15]等。

羌活勝濕湯由羌活、獨活、藁本、甘草、蔓荊子、防風、川芎組成，搭配經典，配伍巧妙，方中羌活擅長祛除上半身風濕，獨活擅長祛除下半身風濕，兩藥合用，則一身風濕盡除，疏通關節而能通痹止痛，同為君藥；防風和藁本俱為祛風藥，防風祛風除濕以解表，藁本辛散溫通散寒濕邪，兩藥合用，助羌活、獨活祛風勝濕之力，為臣藥；川芎辛溫香燥，走而不守，能活血行氣，祛風止痛，蔓荊子祛風除濕利關節，合為佐藥；炙甘草為使藥，調和諸藥；全方共奏祛風勝濕之效，臨床治療強直性脊柱炎效果顯著，但其作用機理尚未明確，本文采用網絡藥理學方法預測其作用靶點，探討其可能的作用機理。

1 資料與方法

1.1 羌活勝濕湯活性成分檢索在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)依次檢索羌活、獨活、藁本、甘草、蔓荊子、防風、川芎的化學成分，以口服利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為條件進行篩選，得到羌活勝濕湯的活性成分，并通過TCMSP數據庫進一步預測所有活性成分的潛在靶點，將獲得的靶點數據錄入UniProt蛋白質數據庫進行標準化。采用Cytoscape3.8.2 軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.2 強直性脊柱炎相關靶點的獲取在GeneBank數據庫(https：//cipotato.org/genebankcip/)及人類基因數據庫(https：//www.genecards.org/，GeneCards)以“Ankylosing Spondylitis(AS)”為關鍵詞進行檢索，獲取強直性脊柱炎的相關靶點。采用Venn2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線平臺獲取藥物靶點和疾病靶點的交集靶點，即為羌活勝濕湯治療強直性脊柱炎的潛在靶點。

1.3 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡圖構建把藥物和疾病的交集靶點導入STRING(https：//string-db.org/)在線數據庫，物種設置為人(Homo sapiens)，構建交集靶點之間的蛋白互作網絡圖。

1.4 富集分析將交集靶點導入Metascape(https：//metascape.org/gp/index.html)在線數據庫，物種設置為智人(Homo sapiens)，選擇自定義分析，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并將富集結果可視化。

2 結果

2.1 羌活勝濕湯活性成分篩選在TCMSP檢索得到羌活勝濕湯組方中藥的化學成分，以OB≥30%和DL≥0.18為標準進行篩選，得到羌活勝濕湯活性成分61個，其中羌活10個，獨活6個，甘草16個，藁本1個，蔓荊子14個，防風10個，川芎4個；預測得到羌活勝濕湯活性成分相關靶點265個。

2.2 疾病靶點及藥物治療AS的潛在靶點的獲取通過檢索 GeneBank和 GeneCards 數據庫，去掉重復值后得到疾病靶點1 672個。將羌活勝濕湯活性成分的相關靶點與強直性脊柱炎疾病相關靶點進行映射，得到26個交集靶點，即為羌活勝濕湯治療強直性脊柱炎的潛在靶點，使用Venn圖對結果進行可視化。見圖1。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖利用 Cytoscape3.8.2 軟件構制“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，圖中共有 311個節點，其中藥物活性成分61個，藥物節點6個(藁本成分只有一個且為共同成分，故未顯示)，靶點節點239個。圖中淺青色代表獨活活性成分，淺黃色代表蔓荊子活性成分，淺橘色代表防風活性成分，淺綠色代表甘草活性成分，淺粉色代表川芎活性成分，棕色代表羌活活性成分，淺藍色代表靶點。

圖1 交集靶點的Venn圖

注：QH：羌活；DH：獨活；GC：甘草；FF：防風；CX：川芎；MJ：蔓荊子圖2 “藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖

2.4 PPI 網絡圖將交集靶點導入STRING數據庫構建蛋白質相互作用關系網絡圖，圖中共有26個節點，101條邊，平均節點數為7.77，節點代表靶蛋白，邊代表靶蛋白之間的相互作用關系。見圖3。

2.5 GO功能富集分析利用Metascape數據庫對羌活勝濕湯作用于強直性脊柱炎的有效作用靶點進行GO功能富集分析得到GO條目620條，其中生物學過程(biological process，BP)有475條，主要有脂質生物合成過程、對有毒物質調節激素水平的反應、輔助因子代謝過程等；分子功能(molecular function，MF)共124條，主要是影響酶的活性，如氧化還原酶活性、類固醇羥化酶活性等；細胞組成(cellular component，CC)共21條，涉及細胞質核周區、細胞器包膜囊腔、線粒體包膜等。見圖4-圖6。

圖3 交集靶點的PPI 網絡圖

圖4 GO富集分析中的BP分析圖

圖5 GO富集分析中的MF分析圖

2.6 KEGG通路富集分析利用Metascape在線數據庫對羌活勝濕湯治療強直性脊柱炎的有效作用靶點進行KEGG通路富集分析。以P<0.05、FDR<0.05為標準進行篩選，共得到28條信號通路，主要有類固醇激素生物合成通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等。見表1。

表1 KEGG通路結果分析

圖6 GO富集分析中的CC分析圖

3 討論

中醫認為強直性脊柱炎腎虛為本，病在督脈[16]。國家中醫藥管理局2010年制定的《22個專業95個病種中醫診療方案》中將本病分為腎虛督寒型及腎虛濕熱型。督脈陽氣不足，風、寒、濕、熱等邪入侵，督脈起于胞中，行于脊背，腎陽不足，則督脈無以主一身之陽經，同時陽虛寒凝，寒則痛甚，故脊背痛甚[17]。因此，中醫將AS歸屬于“痹證”“大僂”“骨痹”“竹節風”“龜背風”“腎痹”“脊強”“筋痹”“督脈病”“背僂”“腰痛”等范疇[18-20]。《黃帝內經》記載：“骨痹不已，復感于邪，內舍于腎，腎痹者，尻以代踵，脊以代頭”，意指不能直立行走，臀部代替雙足，脊柱彎曲程度嚴重，從遠處看像頭一樣，形象的描述了本病引起的脊柱及髖關節的畸形。《黃帝內經》中還記載“陰氣者，開闔不得，寒氣從之，就生大僂”。王冰著說“身體俯曲，不能直立，僂，脊柱彎曲”，也是對本病的描述。中醫認為痹癥的外因是風寒濕，風寒濕三氣雜至，合而為痹，內因與稟賦不足，先天腎精虧虛，督脈空虛有關，內外邪氣相合，阻礙機體陽氣運行，不通則痛而發病。因此，AS臨床治療時扶正祛邪兼顧，方能治本。羌活勝濕湯有祛風勝濕之效，臨床治療AS效果顯著。

網絡藥理學研究顯示，川芎通過調節NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)、T細胞受體、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、環磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K-Akt)等信號通路治療AS[21]。川芎的成分之一楊梅素具有免疫調節的作用，有益于疼痛性疾病的治療[22]，可以下調NF-κB結合活性，從而抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的IL-12的產生[23]。研究發現，獨活治療AS有26個關鍵靶點[24]，其中人類白細胞抗原B27(human leucocyte antigen-B27，HLA-B27)和白細胞介素 23 受體(interleukin-23 receptor，IL-23R)基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)[25]是AS發病的公認假設；Toll樣受體、NF-κB、NOD樣受體、腸道免疫、T細胞受體等是治療AS的免疫相關通路；脂肪因子、Janus激酶(janus kinase，JAK)/信號轉導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)通路等是治療炎癥的通路；Wnt /β-catenin 信號[26]、TNF、破骨細胞分化、類固醇激素的合成等是治療骨代謝的相關通路。姜平等[27]的數據挖掘分析顯示，治療AS最常用的組合是獨活-防風，應用網絡藥理學分析此藥對共含有21個有效成分，對應靶點237個，其中關鍵成分可能是β-谷甾醇、漢黃芩素等。段凱旋等[28]研究顯示，羌活-獨活藥對共有15個抗炎成分，作用于49個靶點，共同參與47個生物過程。謝恒韜等[29]研究發現，在大鼠模型中，羌活能夠降低炎癥中NF-κB的水平，和強直性脊柱炎的發病相關。以上研究表明，羌活、獨活、防風等羌活勝濕湯的組方藥材均可通過多成分、多靶點、多途徑發揮治療AS的作用。

本文探討了中藥復方羌活勝濕湯治療AS的可能靶點和通路發現，疾病和藥物的交集靶點有26個，羌活勝濕湯主要成分有升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸、羌活醇、藁本內酯、蛇床子素等，通過調節NOD樣受體、T細胞受體、腫瘤壞死因子-α、Toll樣受體、環磷腺苷、類固醇激素的合成等通路，作用于HLA-B27和 IL-23R SNP等強直性脊柱炎疾病靶點。說明羌活勝濕湯可通過多途徑、多靶點、多層次作用于AS。該研究為深入理解藥物-靶點之間相互作用提供了重要參考信息，同時為中醫藥治療強直性脊柱炎的機制研究做出探索。