腎虛質、脾虛質大鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10表達差異性研究*

孫瑜嬬，孫理軍，王梓安，史鵬云

陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

中醫學中脾與腎的功能不僅包括解剖學的脾腎兩臟，還包括神經、內分泌、免疫等多個系統，與機體生長發育、衰老、消化吸收、氣血生成及津液輸布密切相關[1-2]。水谷是五液生成的物質基礎，依賴脾胃的運化、轉輸注于臟腑，最后歸藏于腎中。脾腎兩臟均參與了水液的運行輸布，其津液沿脾腎兩經脈上乘達口腔，形成涎唾。《素問·宣明五氣》曰：“五臟化液……脾為涎，腎為唾。”脾開竅于口，主運化水谷精微，能夠促進食物的消化、吸收，并且將營養物質輸布與傳送。脾為涎，唾液的生成源于脾運化的水谷精微，而唾液又能促進脾的運化功能。腎者水臟，主津液，腎臟化生唾液，使其源源而上，充于口中不至溢于口外，主要是依賴腎陽的溫煦、氣化及收納、封藏功能來實現的。

涎和唾均為口腔分泌物，是由舌下腺、腮腺、下頜腺等唾液腺共同分泌的液體，臨床實際中很難將其區分開，故又合稱為口水、唾液等[3]。本文通過制備腎虛體質與脾虛體質動物模型，研究不同體質狀態下唾液細胞因子的變化，探討腎虛體質和脾虛體質對唾液腺功能的影響。

1 材料

1.1 動物8周齡SPF級SD大鼠，雌鼠15只，雄鼠5只，體質量180～220 g，購買于西安第四軍醫大學實驗動物研究中心，合格證號：SCXK(陜)2018-003。室溫20～26 ℃，標準飼料喂養，自由飲水進食。成熟土貓1只，兇狠善叫，前期貓糧喂養，造模期間以貓糧并不定期投入實驗淘汰掉的子代鼠喂養。

1.2 藥物與試劑匹魯卡品(山東博士倫福瑞達制藥有限公司生產，國藥準字：H19983028)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：EK0526、EK0374、EK0418)；生理鹽水(西安京西雙鶴藥業有限公司，批號：172703)。

1.3 儀器FT-200型小動物跑步機(成都泰盟軟件有限公司)；HJT-B型天平(華杰電子有限公司)；CB880V型潔凈工作臺[蘇潔醫療器械(蘇州)有限公司]；PHS-2C 型pH計(上海康儀儀器有限公司)；DY89-1型勻漿機(寧波新芝生物科技有限公司)；DHP-9052型電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；Elx808IU型酶標儀(美國Biotek公司)；CR22GⅡ型低溫離心機(離心半徑：13.5 cm，日本日立公司)。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備20只SD大鼠常規飼養1周后，按雌雄比例3：1進行合籠交配。待雌鼠成功受孕后，將15只孕母鼠隨機分為A、B、C三組(n=5)。A組孕鼠每日800—2000置于特質鼠籠，將鼠籠固定于內有兇狠土貓的大籠內，孕鼠與土貓間僅有一層鐵絲網相隔，貓爪能夠觸碰孕鼠但不能將之捕獲，使A組孕鼠處于恐嚇狀態直至先天不足的仔鼠出生。B、C組孕鼠不做任何刺激。非恐嚇時間A、B、C三組孕鼠均置于相同環境下確保其他非處理因素一致，直至三組孕鼠產下仔鼠。A組仔鼠正常喂養4周后隨機選取10只，雌雄各半，繼續上述“貓嚇鼠”恐嚇方案，并不定期投入實驗淘汰掉的仔鼠喂養土貓，使仔鼠在旁觀看強化恐嚇刺激，持續4周，所得仔鼠即為“先天不足+后天失養腎虛質”型小鼠[4-8]，記為腎虛質組。B組仔鼠正常喂養4周后隨機選取10只，雌雄各半，不規律喂食使其饑飽無度，并于每日800將其放置在小動物跑步機上跑步30 min，速度10 m·min-1，不設坡度，六個跑道后方均裝有電擊裝置，仔鼠若觸碰則會遭受電擊。為避免電擊懲罰，仔鼠將持續向前奔跑直至精疲力竭。以仔鼠出現跑步吃力、半臥位姿勢跑步、降低跑道轉速度后仍無法恢復跑動能力，停止運動后出現氣促、神倦，且對外界刺激不敏感為力竭標準。4周后所得仔鼠即為“飲食不節+勞倦過度復合型脾虛質”模型小鼠[9-10]，記為脾虛質組。C組仔鼠隨機選取10只，雌雄各半，標準飼料喂養，自由飲水進食8周，記為平和質組。

2.2 各組仔鼠一般情況檢測分別在仔鼠6周齡和8周齡時稱其質量，并觀察各組仔鼠的神態、活動能力、飲食、毛色等變化。

2.3 各組仔鼠唾液pH值檢測造模結束后，各組仔鼠禁食12 h后稱其質量，以10 mL·kg-1劑量腹腔注射300 mg·kg-1水合氯醛進行麻醉[11]，麻醉后腹腔注射0.2% 匹魯卡品(7.5 mg·kg-1)促進唾液分泌[12]，于仔鼠麻醉狀態下收集口腔唾液；將收集的唾液3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，進行唾液pH值檢測。

2.4 唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10表達檢測處死動物后摘取唾液腺，放入加有生理鹽水的離心管中并置于冰上進行組織勻漿，防止高溫破壞活性。組織勻漿液以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存。TNF-α、IFN-γ、IL-10采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行檢測。將試劑盒取出后復溫 30 min，設標準孔和樣本孔，每孔設1個復孔，依次滴加標準品和稀釋的待測樣本各100 μL，37 ℃密封孵育90 min；反應后棄液體并吸干多余水分；除空白孔外，每孔滴加抗體工作液100 μL，37 ℃密封孵育60 min；洗滌液清洗3次，每次1 min；除空白孔外，每孔滴加ABC Diluent Buffer 100 μL，37 ℃反應30 min，洗滌液清洗5次，每次1 min；每孔滴加顯色液90 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔滴加終止液100 μL，15 min內采用酶標儀于450 nm波長處檢測OD值。

3 結果

3.1 各組仔鼠一般生長情況比較平和質組仔鼠飲食正常，體格健碩，體質量增長迅速，精神良好，活動度高，毛發密實有光澤，二便正常。腎虛質組小鼠在造模過程中出現孕鼠成群蜷縮在籠子角落，瑟縮易驚、大小便增多、攝食量減少、產子量明顯減少的現象，仔鼠體格瘦小，蜷臥少動，皮毛松弛，毛發稀疏灰暗、光澤度差。脾虛質組仔鼠隨著造模進行出現飲食逐漸減少，形態消瘦、體質量增長緩慢、精神萎靡不振、大便增多等現象。仔鼠第6、8周體質量對比發現，與平和質組比較，腎虛質組仔鼠第8周體質量及兩周內體質量增長顯著降低(P<0.01)，脾虛質組第6、8周體質量及兩周內體質量增長均顯著降低(P<0.01)；與腎虛質組比較，脾虛質組第6、8周時仔鼠體質量及兩周內體質量增長均顯著降低(P<0.01)。見表1。

3.2 各組仔鼠唾液pH值比較與平和質組比較，腎虛質組、脾虛質組小鼠唾液pH值顯著升高(P<0.01)；與腎虛質組比較，脾虛質組小鼠唾液pH值無明顯變化。見表2。

表2 各組仔鼠唾液pH值比較

3.3 各組仔鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10含量比較與平和質組比較，腎虛質組小鼠唾液腺中IFN-γ、IL-10的含量顯著降低(P<0.01)，TNF-α含量無明顯變化；脾虛質組小鼠唾液腺中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，IFN-γ和IL-10含量顯著降低(P<0.01)；與腎虛質組比較，脾虛質組小鼠唾液腺中TNF-α、IFN-γ、IL-10含量無明顯變化。見表3。

表3 各組仔鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10含量比較

表3 各組仔鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10含量比較

組別nTNF-αIFN-γIL-10平和質組10180.62±24.9153.54±8.2728.74±2.21腎虛質組10196.34±20.4239.26±7.72??25.24±2.43?脾虛質組10201.99±11.71?42.85±5.86??23.57±3.99??

注：與平和質組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

“唾”與“涎”是中醫“五液”中的重要概念，二者無論是生成、與臟腑的關系或是病理變化等都有區別，但同屬口腔分泌物，臨床實際中很難將二者截然區分，因此合稱為唾液、唾沫。《靈樞·九針論》言：“五液：心主汗、肝主泣、肺主涕、腎主唾、脾主涎，此五液所出也”，明確提出脾腎與涎唾密切相關。《說文解字》又言：“唾，口液也”“涎，慕欲口水也”。《辭海》云：“唾為口液”“涎即唾液。”《辭源》曰：“唾為唾沫”“涎為口液”。唾液與脾腎密切相關[13-17]，脾腎兩臟均參與了水液的運行輸布，使津液沿脾腎兩經脈上乘達口腔，形成涎唾。足太陰脾經起于足大趾，上行挾咽，連于舌本，散于舌下。廉泉，也為脾脈所系，涎為上出于廉泉之液。腎所藏之津，經足少陰腎經循行，起于足小趾，上行沿喉嚨至舌根，自廉泉出于舌之端形成唾。從現代醫學來看，唾液腺的解剖位置(第二磨牙附近、口腔底部及舌系帶兩旁的口腔黏膜)正是脾腎兩經脈的循行范圍。所以，唾液的分泌受脾腎兩經的控制，脾腎兩臟功能的盛衰，直接影響唾液分泌量的多寡。

脾開竅于口，主運化水谷精微，能夠促進飲食的消化、吸收，并且將營養物質輸布與傳送。脾之健運，則食物攝納正常，口腔分泌的唾液不僅可以潤澤食物，而且可對食物進行初步的消化。脾主運化水濕，唾液化源于脾，又受脾的制約，通過脾陽的氣化與固攝，口中的涎液既不會因為涎液過多溢于口外，也不至于干涸少涎而引起口燥咽干的不適。腎為水臟，唾為精汁，腎臟化生唾液，使其源源而上，充于口中不至溢于口外。腎氣充足，蒸騰氣化津液，唾液不斷泌泄，則口腔潤澤。若腎氣不足，溫煦、攝納失藏，則唾液泌泄失常，可能出現多唾、久唾或少唾、無唾的病證。腎為先天之本，脾為后天氣血生化之源，脾腎兩臟共同調節著津液在體內的運行輸布。“脾陽根于腎陽”，脾之健運，運化水谷精微的功能依賴腎陽的溫煦；但腎中精氣的充足與否則依賴脾運化的水谷精微的充養。所以，唾液的分泌，受脾腎兩臟相互資助，共同發揮其生理功能。

以腎中精氣虧損、臟腑功能低下為主要特征的腎虛質和以脾氣虧虛、脾胃功能低下的脾虛質同屬病理體質[18]，研究不同病理體質下，唾液pH值、唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10表達水平的差異，是本實驗的重點。研究結果發現，與平和質組比較，腎虛質、脾虛質大鼠體質量和凈增長均顯著降低，唾液pH值顯著升高，提示病理體質大鼠的生長發育低于正常大鼠，唾液腺性狀和功能已發生明顯改變。由于腎虛質時，腎精虧虛，導致脾不健運、唾液分泌異常；脾虛質脾胃功能衰退，樞機不利，氣血生化無源，不能充養四肢，直接導致肌肉瘦削，故脾虛質模型大鼠體型更小、體質量更低，提示脾虛質對體質量的影響較腎虛質更主要、更直接。

細胞因子是多種細胞所分泌的低分子量可溶性蛋白質，屬于生物信息分子，具有調節免疫功能，參與炎癥發生、創傷愈合，并刺激細胞活化、增殖和分化等。對唾液腺中TNF-α、IFN-γ、IL-10的表達水平檢測發現，與平和質組比較，腎虛質、脾虛質組IFN-γ和IL-10含量降低，且脾虛質組TNF-α含量升高。TNF-α為炎性因子，主要由T細胞等免疫細胞產生，在細胞增殖、分化及凋亡等方面發揮重要作用，并參與肝癌在內的多種腫瘤疾病的發生和發展，激活中性粒細胞和淋巴細胞，調節機體的免疫功能，維持機體內部的穩定，防止眾多致病因子對機體的侵害，是不可或缺的免疫調節因子[19-20]。本研究中，脾虛質TNF-α含量升高，提示免疫平衡出現失調，體內釋放的大量TNF-α與其它炎癥因子共同作用，造成病理損傷出現。IFN-γ能激活巨噬細胞和B淋巴細胞，增強抗原遞呈作用，促進多種細胞因子的分泌，具有抗病毒、抗腫瘤作用，可增強機體免疫調節功能，通過增強Th1細胞的活性而增強細胞免疫；還可通過抑制Th2的細胞增殖而抑制體液免疫，即可通過不同途徑、不同機制發揮抗病毒和免疫調節作用[21-22]。腎虛質組、脾虛質組IFN-γ含量降低，提示在腎虛、脾虛的病理體質下，機體免疫失衡，免疫功能降低。IL-10是公認的抗炎因子，是免疫過程中重要的負調節因子，主要來源于活化的T細胞和巨噬細胞，具有很強的抗炎和免疫抑制活性，能抑制促炎因子的釋放和抗原的遞呈，下調單核細胞、巨噬細胞分泌TNF-α、IFN-γ等，直接或間接抑制炎癥反應[23-24]。腎虛質、脾虛質組 IL-10 含量降低，脾虛質組TNF-α含量升高，提示抗炎反應與促炎反應失衡，模型動物免疫穩態遭到破壞，但腎虛質、脾虛質組間比較，上述指標差異無統計學意義。

綜上所述，兩種模型的造模方法可見相應體質所應有的癥狀表現，腎虛體質與脾虛體質較平和質組出現免疫穩態失衡，但腎虛體質與脾虛體質組間比較，所觀測指標上并沒有顯著性差異，進一步闡述了中醫“脾在液為涎”“腎在液為唾”理論的內涵，涎唾分泌于口，為脾腎共同所主。