腎消方對糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的干預作用*

職小飛，張克清，李相中

1.鄭州大學第一附屬醫院附屬安陽醫院，河南 安陽 455003； 2.安陽市中醫院，河南 安陽 455003

糖尿病目前已成為第三大危及公眾健康的慢性非傳染類疾病，至2020年底，我國成年人群體中，糖尿病患者數量約為1.14億[1-2]。1型糖尿病與2型糖尿病病人中存在腎病問題的比例分別為 15%～25%、30%～40%，龐大的糖尿病患者基數導致糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的高發、多發，給社會與家庭造成負擔。DN患者除糖尿病的“三多一少”表現外，還出現高血壓、持續性白蛋白尿、進行性腎功能損傷等癥狀[3-5]。腎消方由生黃芪 30 g，地龍10 g，人參10 g，桔梗10 g，桂枝 6 g，牛膝15 g，升麻10 g，赤芍10 g，桃仁10 g與川芎10 g等組成，是在補中益氣湯及血府逐瘀湯的基礎上進行加減變化而成。補中益氣湯出自李東垣所著《脾胃論》[6]，血府逐瘀湯的出處為《醫林改錯》[7]，在王清任所創的“逐瘀湯”系列方中，此方劑應用率最高。近年來，已有臨床報道補中益氣湯及血府逐瘀湯對于DN有一定療效，但二者化裁方腎消方對DN的作用效果鮮有臨床報道。因此，本實驗旨在探究腎消方能否改善DN大鼠腎損傷，為臨床應用與機制探究提供理論依據。

1 材料

1.1 動物90只清潔級雄性SD大鼠，體質量100～140 g，由河北省實驗動物實驗室提供，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。實驗大鼠飼喂于溫度22～25 ℃、相對濕度40%～60%、12 h交替照明的環境下，飲水、飲食不限制。本研究經鄭州大學第一附屬醫院附屬安陽醫院動物倫理委員會批準，批準號：2019DWLL-023。

1.2 藥物與試劑生黃芪、地龍、人參、桔梗、桂枝、牛膝、升麻、赤芍、桃仁、川芎(北京同仁堂藥店)；厄貝沙坦片(規格：0.15 g，杭州賽諾菲制藥有限公司，批號：4A293)；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，上海源葉生物科技有限公司，批號：200324)；酒精醋酸福爾馬林混合(FAA)固定液(上海歌凡生物科技有限公司，批號：200127)；尿蛋白(urine total protein，UTP)測定試劑盒(青島市三凱醫學科技有限公司，批號：200115)；血肌酐(serum creatinine，Scr)測定試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司，批號：190923)；尿素氮(urea nitrogen，BUN)測定試劑盒(北京盒子生工科技有限公司，批號：200413)；尿酸(uric acid，UA)測定試劑盒(上海滬崢生物科技有限公司，批號：191103)；總蛋白(total protein，TP)測定試劑盒[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：200214]；白蛋白(albumin，ALB)檢測試劑盒(BCG比色法，上海羽哚生物科技有限公司，批號：020128)；醋酸鈾(西安鼎天化工有限公司，批號：190324)；檸檬酸鉛(上海一基實業有限公司，批號：210114)；尿肌酐(urine creatinine，Ucr)檢測試劑盒(干化學法，上海翰聯醫療技術股份有限公司，批號：200615)；糖原PAS染色試劑盒(上海紫一試劑廠，批號：191221)。

1.3 儀器MDF-382E型醫用超低溫冰箱(日本三洋電機公司)；LD4-2A型低速離心機(離心半徑：13.5 cm，北京醫用離心機廠)；TEC-2800型自動組織包埋機(上海精密儀器儀表廠)；47MICROM-340E型石蠟切片機(德國Zeiss公司)；BM-10型顯微鏡(上海光學儀器一廠)；EMUC7型超薄切片機(德國Leica公司)；BX63+DP72型正置研究級顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；7600-020型全自動大型生化分析儀、H-7650型透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。

2 方法

2.1 腎消方水煎液的配制向藥材中加入8倍量的水，浸泡0.5 h后，武火煮開，文火煎煮40 min，對藥液進行過濾處理；藥渣中加入6倍量水，煎煮 0.5 h 后，過濾取濾液，然后將兩次藥液充分混合。通過煎煮將腎消方藥液濃縮為濃度分別是 1 g·mL-1、2 g·mL-1與4 g·mL-1的溶液。

2.2 模型制備、分組與給藥90只雄性SD大鼠適應性喂養7 d后，隨機選取10只大鼠為正常組，普通飼料飼養；其余80只大鼠采取高脂高糖飼料飼喂的同時腹腔注射小劑量STZ建立DN模型[8]。6周后檢測造模大鼠的血糖，若血糖值≥16.7 mmol·L-1，表示DN建模成功。造模過程中，大鼠死亡6只，剔除血糖值<16.7 mmol·L-1的大鼠2只。隨機將造模成功的大鼠分成模型組(n=15)、厄貝沙坦組(n=14)及腎消方低(n=14)、中(n=14)、高(n=15)劑量組。分組完成后對大鼠進行相應藥物灌胃干預處理，參照藥物成人臨床應用劑量，根據人與大鼠體表面積法對大鼠灌胃劑量進行計算[9]，則腎消方低、中、高劑量組大鼠分別以5.63 g·kg-1、11.26 g·kg-1、22.52 g·kg-1的劑量灌胃給予腎消方溶液，厄貝沙坦組大鼠以14.12 g·kg-1的劑量灌胃給予厄貝沙坦，模型組和正常組灌胃給予等體積的純凈水，每天1次，連續給藥20周。

2.3 肝功能、腎功能的檢測每只大鼠采集3 mL血液，通過離心處理，分離血清，采用全自動大型生化分析儀對TP、Scr、ALB、UA與BUN進行測定。

2.4 24 h UTP的檢測通過代謝籠留取大鼠24 h尿液，3 500 r·min-1離心10 min，取上清，根據UTP檢測試劑盒說明書操作，借助終點法對尿中蛋白濃度進行測定，蛋白濃度與尿量的乘積即為24 h UTP值。

2.5 內生肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)的計算通過全自動大型生化分析儀對20周末每組實驗動物尿肌酐(urine creatinine，Ucr)水平進行測定，計算大鼠的Ccr，以此反映腎小球的濾過能力。

2.6 腎小球體積的計算將腎組織于FAA固定液內固定處理24 h，充分流水沖洗，脫水、浸蠟，最后石蠟包埋處理，切片，調整為2 μm厚度，PAS染色液染色，光鏡下進行觀察，并借助軟件CellSens Dimension以光鏡下拍到的照片為對象通過逐點描繪區域法對腎小球面積進行測定，取5個腎小球面積的平均值為該只大鼠腎小球平均面積(mean glomerular area，MA)，并計算腎小球體積(glomerular volume，GV)。

GV=MA×1.5×0.75+0.21

2.7 透射電鏡觀察腎臟病理變化取左側腎臟下端，將其切為等體積的小塊，固定、脫水，石蠟包埋，超薄切片機完成切片，用醋酸鈾與檸檬酸鉛進行雙重熒光染色處理，借助透射電鏡觀察腎小球基底膜增厚、足突融合、系膜基質增生等病理性改變，并進行拍照留存。

3 結果

3.1 腎消方對DN大鼠肝功能、腎功能的影響與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN及UA的水平顯著升高(P<0.01)，ALB、PT的水平無明顯變化；與模型組比較，腎消方低劑量組大鼠BUN及UA的水平顯著降低(P<0.05)；腎消方高劑量組大鼠UA的水平顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組大鼠肝功能、腎功能對比

3.2 腎消方對DN大鼠內生肌酐清除率及腎小球體積的影響與正常組比較，模型組Ccr、GV水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，厄貝沙坦組及腎消方低、中、高劑量組Ccr、GV水平顯著降低(P<0.05)；與厄貝沙坦組比較，腎消方低、高劑量組GV水平顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注：A：各組ALB的結果圖；B：各組TP的結果圖；C：各組Ccr的結果圖；D：各組GV的結果圖；與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01；與厄貝沙坦組相比，□P<0.05，□□P<0.01圖1 腎消方對DN大鼠腎功能及腎小球體積的影響

3.3 腎消方對DN大鼠24 hUTP定量的影響與正常組比較，模型組大鼠4周、8周、12周、16周、20周時的24 hUTP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，厄貝沙坦組及腎消方低、中、高劑量組大鼠4周、8周、12周、16周、20周時的24 hUTP水平顯著降低(P<0.05)；與厄貝沙坦組比較，腎消方低劑量組大鼠16 W、20W時的24 hUTP水平顯著降低(P<0.05)；與腎消方低劑量組比較，腎消方中劑量組大鼠16周、20周時的24 hUTP水平顯著升高(P<0.05)，腎消方高劑量組大鼠20周時的 24 hUTP 水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠24 hUTP的比較

3.4 腎消方對DN大鼠病理變化的影響光鏡下觀察發現：正常組大鼠腎臟結構無異常，腎小球囊腔寬大；模型組大鼠腎小球肥大且囊腔狹窄，一些節段存在球囊粘連現象，系膜基質分布增多，系膜區寬度增加，基底膜厚度增加(圖2紅色箭頭所示)，腎小管上皮細胞腫脹，腎間質部分纖維化(圖2黑色箭頭所示)。電鏡下觀察顯示：正常組大鼠腎臟超微結構正常，足突(圖3紅色箭頭所示)整齊分布，未見融合現象；模型組大鼠腎小球基底膜厚度增大，足突重度融合，系膜基質增生。與模型組比較，各給藥組大鼠的病理改變均有不同程度的減輕。見圖2、圖3。

注：A：正常組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：腎消方低劑量組；E：腎消方中劑量組；F：腎消方高劑量組圖2 光鏡觀察各組大鼠腎組織結構(PAS染色，×400)

4 討論

DN多為糖尿病患病日久而致，基本病機以脾氣虛弱、清氣下陷致精微下趨為主，多數患者還兼夾瘀血等標證，因此應以健脾益氣、升清活血為治法[10]。腎消方包括生黃芪、地龍、人參、桔梗、桂枝、牛膝、升麻、赤芍、桃仁與川芎等，是在補中益氣湯以及血府逐瘀湯的基礎上進行加減變化而成。本方取補中益氣湯立意補氣升陽為法，以黃芪為君，一是補氣健脾以治氣虛之本，二是升提下陷陽氣，以求濁降清升，脾胃和調，精微物質能化生充足，水谷精氣生化有源，諸癥可以自愈。張山雷[11]在《本草正義》中說黃芪能“補益中土，溫養脾胃，凡中氣不振，脾土虛弱，清氣下陷者最宜”。升麻佐助升舉清陽，《本草綱目》曰“升麻引陽明清氣上行，此乃察賦虛弱，元氣虛餒，及勞役饑飽，生冷內傷，脾胃引經最要藥也”?？虑賉12]《名醫方論》曰：“元氣不足，懶言，氣喘，人參以補之”，方中運用此法旨在糾正氣虛，人參為補陰之品，非熾熱之藥，方中人參氣味甘微寒，能補太陰之生氣，使陽得陰助而生化無窮。通過配伍升麻可使黃芪、人參的補益作用最大限度發揮，既切合早期DN的主要病機，又可照顧兼夾癥。桃仁破血行滯潤燥，紅花活血化瘀止痛，為臨床活血行氣常用組合，兩藥與澤瀉共為血府逐瘀湯的君藥；赤芍、川芎助桃仁、紅花活血祛瘀之功，牛膝活血通經，祛瘀止痛，引血下行。兩方相和，對以脾氣虛弱、清氣下陷致精微下趨為主、兼夾瘀血等證的DN達到標本兼治目的?，F代藥理學研究表明。黃芪、人參、桃仁、川芎、赤芍、牛膝、地龍等具有改變血液動力學異常、抑制血小板黏附、保護腎小球、增加腎動脈灌流量、改善微循環、抑制腎小球硬化等作用[13-18]。

通過觀察腎臟病理能夠發現，腎消方能夠使DN大鼠腎臟損傷有所改善，可減慢腎臟纖維化與腎小球硬化進展速度。相關研究證實，DN蛋白尿和病人病理改變、臨床指標存在聯系，可較為準確的體現腎小球與腎小管間質病變狀況，同時可對腎臟預后進行評估[19-21]。對于糖尿病腎病而言，蛋白尿為其病情進展的獨立風險因子，其進行性增多可導致病情加重，如果長期未獲得有效控制，可導致腎功能受損，產生終末期腎病[22-23]。故而，對于糖尿病腎損傷的防治，蛋白尿的積極有效治療發揮著關鍵作用。本研究結果表明，在糖尿病病程延長的同時，蛋白尿排泄隨之增多，在不同階段，腎消方均能夠使蛋白尿的排泄降低。

Ccr是評估腎小球濾過功能的一項最常用指標，正常情況下，腎臟可有效清除血液中的內生肌酐[24]。DN初期存在腎小球高灌注壓、高濾過表現。GV作為腎功能評價的常用指標，DN時GV水平明顯升高。本研究結果發現，20周末時模型大鼠的腎臟Ccr上升，CV增大，說明其腎臟處在高灌注壓與高濾過水平，而經藥物干預后，各組呈現不同程度的下降，證實腎消方可有效調節糖尿病腎病大鼠Ccr、GV水平，減輕腎小球肥大，在一定程度上改善腎損傷。腎功能是腎臟排泄機體內部代謝垃圾，維持機體酸堿、電解質(包括鈣、鉀與鈉等)平衡的功能[25]，通常通過24 hUTP、Scr、BUN與UA等指標進行評估。本研究顯示，模型組大鼠24 hUTP、Scr、BUN、UA的水平明顯升高，而經藥物干預后其水平降低，提示腎消方可有效降低24 hUTP水平，并在一定程度上對大鼠Scr、BUN、UA水平起到調節作用，使DN大鼠腎功能得到改善。但最新研究證實，高尿酸血癥和腎臟病、糖尿病間存在顯著相關性，高尿酸會導致糖尿病病人的并發癥(包括DN等)提前發生[26]，因此，及時有效的治療高尿酸癥極大程度上有助于DN的防治。

綜上所述，腎消方對糖尿病腎病瘀血阻絡證大鼠腎損傷具有良性干預作用，可使DN大鼠蛋白尿排泄減少，腎小球高灌注壓、高濾過情況得到改善，降低腎臟肥大指數，改善腎臟病理變化，對腎功能起到保護作用。