超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定痤瘡消炎洗劑中8種化學成分含量*

張蓬華，盧偉，陳黎△，葉方

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000）

中醫(yī)藥治療痤瘡歷史悠久，形式多樣，臨床療效確切。中藥外治法包括中藥面膜法、中藥熏蒸法、濕敷法、搽劑法和涂劑法，具有操作簡便、不良反應少等特點［1］。痤瘡消炎洗劑為醫(yī)院中藥復方自制制劑，由黃芩、大黃、黃連、黃柏、野菊花、連翹、甘草7味中藥組方，臨床治療面部粉刺、丘疹、膿皰、結節(jié)等效果良好［2］。其質(zhì)量控制標準為性狀描述和單一薄層色譜鑒別試驗。鄭江萍等［3］采用高效液相色譜（HPLC）法建立了痤瘡消炎洗劑的質(zhì)量標準，將黃芩苷、蒙花苷、大黃酸3種化學成分作為質(zhì)量控制指標，并建立了其HPLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有16個含量較高的共有峰［4］。本研究中選擇痤瘡消炎洗劑7味中藥中含量較高的8種質(zhì)量控制指標成分為研究對象，建立了快速測定其含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity型超高效液相色譜儀（沃特世科技＜上海＞有限公司），配有XEVO TQ型串聯(lián)質(zhì)譜儀；GWAUN1型純水儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；AUW120D型分析天平（島津＜上海＞實驗器材有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

痤瘡消炎洗劑（醫(yī)院制劑，批號分別為20201127，20210129，20210311，規(guī)格為每瓶200 mL）；黃芩苷對照品（批號為110715-201318，純度為93.3%），蒙花苷對照品（批號為111528-201107，純度為86.7%），大黃酸對照品（批號為110757-200206，純度為99.3%），大黃素對照品（批號為110756-201711，純度為99.5%），連翹苷對照品（批號為110821-201213，純度為95.3%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-200609，純度為100%），黃柏堿對照品（批號為111895201504，純度為94.9%），甘草酸銨對照品（批號為110731-201418，純度為93.10%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，德國Merck KGaA公司）；甲酸（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司）；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

1）色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC@BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.3 min時10%B，0.3～0.8 min時10%B～50%B，0.8～3.0 min時50%B～90%B，3.0～4.2 min時90%B，4.2～4.5 min時90%B～10%B，4.5～5.0 min時10%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：45℃；進樣量：5 μL。

2）質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，正負離子掃描方式，多反應監(jiān)測模式；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；毛細管電壓：3.2 kV。質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 8種化學成分的質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry detection parameters of eight chemical components

2.2 樣品與溶液制備

痤瘡消炎洗劑：分別取大黃、野菊花、連翹、黃柏各10 g，黃芩、黃連、甘草各5 g，加水煎煮2次，第1次25 min，第2次20 min，濾過，合并濾液，濃縮至400 mL，每瓶裝200 mL，100℃流通蒸汽滅菌30 min，包裝，即得。

混合對照品溶液：取各對照品適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容（必要時加熱溶解），搖勻，得黃芩苷、蒙花苷、連翹苷、大黃素、大黃酸、小檗堿、黃柏堿和甘草酸（根據(jù)分子量將鹽酸小檗堿和甘草酸銨進行換算）質(zhì)量濃度分別為6.01，9.03，5.02，2.54，3.02，10.02，4.52，7.02 mg/mL的對照品貯備液；分別精密量取各對照品貯備液1 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品，搖勻，精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲（功率為240 W，頻率為40 kHz）10 min，放至室溫，用甲醇定容，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察與定量限確定：取2.2項下混合對照品溶液適量，用0.1%甲酸溶液-甲醇（90∶10，V/V）分別稀釋50倍、100倍、200倍、500倍、1 000倍、2 000倍，制得系列對照品梯度溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、待測物峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2?？梢姡鞒煞仲|(zhì)量濃度在相應范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。取系列對照品梯度溶液，用初始流動相倍比稀釋，按2.1項下試驗條件進樣測定，以信噪比（S/N）為10的質(zhì)量濃度為定量限。結果見表2。

精密度試驗：取線性關系考察項下稀釋100倍的混合對照品溶液，按2.1項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果見表2，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20210311）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表2，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20210311）適量，按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果見表2，表明方法重復性良好。

表2 方法學考察結果Tab.2 Results of the methodology investigation

加樣回收試驗：精密吸取樣品（批號為20210311）2 mL，共9份，分別加入2.2項下混合對照品溶液1，2，5 mL，各3份，混勻，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

精密吸取樣品（批號分別為20201127，20210129，20210311）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，計算8種化學成分的含量。結果見表4。

表4 樣品中8種化學成分含量測定結果（μg/mL）Tab.4 Results of content determination of eitht chemical components in samples（μg/mL）

3 討論

3.1 含量測定指標成分選擇

中藥外治法是將藥物直接用于皮膚、黏膜，從而發(fā)揮局部用藥作用，給藥方便，不良反應少［4］。痤瘡消炎洗劑具有清熱解毒、去脂控油、殺菌消炎之功效，主要用于治療痤瘡的各種臨床癥狀，無激素治療后遺留色素沉著、持久性紅斑、凹陷性或增厚型瘢痕等不良反應。內(nèi)服或外敷黃芩、金銀花、連翹、半夏等中藥，治療痤瘡療效較好［5-7］。連翹、虎杖、黃柏、大黃、黃連、黃芩、金銀花等能有效抑制痤瘡丙酸桿菌的增殖［8-9］，對表皮增厚、角化、毛囊擴張、毛囊內(nèi)角化物質(zhì)、真皮層炎性細胞浸潤等有明顯抑制作用［10］，同時能通過抑制炎性反應而延緩痤瘡的發(fā)病過程［11］。本研究中選取的8種化學成分均為處方藥材的主要活性成分，能全面反映痤瘡消炎洗劑的質(zhì)量。

3.2 檢測方法選擇

本研究中采用UPLC-MS/MS法測定痤瘡消炎洗劑中黃芩苷、小檗堿、黃柏堿、大黃素、大黃酚、連翹苷、蒙花苷和甘草酸的含量，在質(zhì)譜掃描模式下，樣品中其他物質(zhì)不會對待測成分產(chǎn)生干擾，檢測不受色譜分離度的影響，在短時間內(nèi)即可達到有效分離。而上述成分的紫外最大吸收波長不同，且含量差異大，相同樣品濃度在紫外檢測器上的響應不同，故采用UPLC-MS/MS法可實現(xiàn)同時快速、準確地檢測樣品中的多種成分。

3.3 流動相選擇

分別考察了甲醇-水、甲醇-醋酸銨溶液（2 mmol/L）、0.1%甲酸溶液-甲醇、乙腈-水、0.1%甲酸溶液-乙腈等流動相，發(fā)現(xiàn)加入醋酸銨后，負離子檢測模式下化合物的響應增加，但正離子檢測模式下化合物的響應顯著降低；加入甲酸后，蒽醌類化合物離子的響應一定程度上會降低。分析其原因為蒽醌類物質(zhì)在電噴霧電離條件下易失去H+帶負電荷，而酸的加入會抑制其電離，致使離子響應降低，但加入甲酸的流動相能使正離子檢測模式化合物的響應顯著增加［12］。綜合對不同化合物信號響應的影響，最終采用0.1%甲酸溶液-甲醇為流動相。