甘露醇原料藥及其制劑中甘露醇的高效液相色譜-電噴霧檢測器分析方法*

趙慧，王董云，吳珺

（江蘇省泰州市藥品檢驗院，江蘇 泰州 225300）

甘露醇（D-甘露糖醇）為良好的脫水利尿藥，臨床常用于降眼壓、降顱內壓等，也常用于治療急性腎功能衰竭的尿閉癥。甘露醇也為常用藥用輔料，可用作藥物制劑的賦形劑，固體、液體的稀釋劑，以及凍干粉針劑的載體［1］。2020年版《中國藥典（二部）》中采用高效液相色譜（HPLC）法測定其有關物質，但靈敏度低、柱溫高、適用性差等；采用容量分析法測定甘露醇含量，操作煩瑣，專屬性差［2］。目前，甘露醇及其制劑中甘露醇的研究方法主要有HPLC法、離子色譜法、旋光法、紫外-可見分光光度法等［3-5］，其中應用較廣的是HPLC法，大多采用蒸發光散射檢測器（ELSD）或示差檢測器（RID）進行測定［6-7］。ELSD大多采用氨基柱，存在柱效下降快、靈敏度低等問題；RID大多采用離子交換柱，存在柱溫高、適用性差、基線波動大等問題。電噴霧檢測器（CAD）是一種新型通用檢測器，具有靈敏度高、重復性好等優勢，且檢測信號響應不依賴于被測物的化學結構，適用于不揮發性或半揮發性物質的檢測，被廣泛應用于皂苷類、糖類、生物堿類、脂類化合物等無紫外吸收或弱紫外吸收組分的測定［8］。本研究中采用HPLC-CAD法對甘露醇原料藥及其制劑中的甘露醇進行分析，具有簡便、快速、靈敏、準確等優勢。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），配有UltiMate 3000型四元泵、UltiMate 3000型自動進樣器、Corona Veo RS型電噴霧檢測器、ChromeleonTM色譜工作站；KH-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）；Mettler XSE205DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

甘露醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100533-201304，含量為99.0%）；乙腈（色譜純，西班牙Scharlau公司）；鹽酸、氫氧化鈉、30%過氧化氫（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；試驗用水均由Milli-Q純水系統制備；甘露醇原料藥3批；注射用胸腺五肽為胸腺五肽加適量甘露醇經冷凍、干燥制成的無菌凍干品，共3批，擬采用注射用胸腺五肽進行制劑中甘露醇的測定。各樣品批號和來源見表1。

表1 樣品批號和來源Tab.1 Batch numbers and sources of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge Amide柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈-水（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；電噴霧檢測器參數：霧化溫度為55℃，冪率為1.0，采樣頻率為10 Hz，過濾常數為3.6 s。

2.2 溶液制備

取甘露醇對照品10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為對照品溶液。取甘露醇樣品10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為甘露醇供試品溶液。取注射用胸腺五肽內容物適量，精密稱定，加水適量，超聲使溶解，用水稀釋成每1 mL約含0.1 mg甘露醇的注射用胸腺五肽供試品溶液。取甘露醇樣品約50 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為有關物質測定用供試品溶液；精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，作為有關物質測定用對照品溶液。以水作為空白溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取空白溶液，2.2項下甘露醇對照品溶液、甘露醇供試品溶液及注射用胸腺五肽供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果表明，空白溶劑對主峰無干擾，樣品中雜質對測定無干擾，甘露醇色譜峰理論板數大于5 000，拖尾因子小于1.2。

1.甘露醇A.注射用胸腺五肽供試品溶液B.空白溶液C.甘露醇供試品溶液D.甘露醇對照品溶液圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖1.MannitolA.Test solution of Thymopentin for Injection B.Blank solution C.Test solution of mannitol D.Reference solution of mannitolFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

破壞性試驗：取甘露醇對照品10 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加水適量使溶解，分別進行以下破壞性試驗。1）堿破壞。加入0.1 mol/mL氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置4 h，加入0.1 mol/mL鹽酸溶液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。2）酸破壞。加入0.1 mol/mL鹽酸溶液1 mL，室溫放置4 h，加入0.1 mol/mL氫氧化鈉溶液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。3）氧化破壞。加入30%過氧化氫溶液1 mL，室溫放置4 h，用水稀釋至刻度，搖勻。4）高溫破壞。水浴加熱4 h，放冷至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述破壞后的試驗溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結果各破壞性試驗產生的雜質峰均能與甘露醇主峰達到有效分離，對測定無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關系考察：取甘露醇對照品20 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取適量，用水分別稀釋成質量濃度為10，20，50，100，200 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取上述溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣測定。以甘露醇的峰面積（Y）為縱坐標、對照品溶液質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1.967 5X+25.487 0（r=0.997 8，n=5）。結果表明，甘露醇質量濃度在10～200 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

1.甘露醇A.高溫破壞B.氧化破壞C.堿破壞D.酸破壞圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖1.MannitolA.High-temperature damage B.Oxidative damage C.Alkali damage D.Acid damageFig.2 HPLC chromatograms of damage tests

定量限和檢測限確定：取甘露醇對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋成系列質量濃度的溶液，并進樣測定，以信噪比（S/N）為3時的質量濃度為檢測限，以S/N為10時的質量濃度為定量限。結果檢測限為0.2 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為0.1 mg/mL的甘露醇對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定。結果甘露醇色譜峰保留時間和峰面積的RSD分別為0.07%和0.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取甘露醇原料藥（批號為FL2005003）及注射用胸腺五肽（批號為19042721）各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算。結果甘露醇及注射用胸腺五肽中甘露醇含量分別為99.21%和0.93 mg/mg，RSD分別為0.34%和0.54%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取2.2項下甘露醇供試品溶液適量，分別于0，4，8，12 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果甘露醇色譜峰峰面積的RSD為1.20%（n=4），表明甘露醇供試品溶液在常溫下12 h內穩定。

耐用性試驗：通過調節流動相比例、流速及柱溫，考察甘露醇主峰的拖尾因子及與相鄰雜質峰的分離情況。結果甘露醇峰的拖尾因子均小于1.2，雜質對主峰無干擾，表明方法耐用性良好。

加樣回收試驗：取已知甘露醇含量的注射用胸腺五肽（批號為19042721）9份，精密稱定，每組3份，分別按比例精密加入相當于甘露醇含量80%，100%，120%的甘露醇對照品，加水溶解，分別制成高、中、低3個濃度的供試品溶液，平行3次。按2.1項下色譜條件各進樣測定，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

分別取甘露醇原料藥（批號分別為FL2005003，E790G，361512014），注射用胸腺五肽（批號分別為19082321，19042721，18092521）和甘露醇對照品（批號為100533-201304）各適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液與對照品溶液，平行2份，每份按2.1項下色譜條件進樣測定2次，記錄峰面積，按外標法計算含量。結果見表3。

表3 甘露醇含量測定結果（n=4）Tab.3 Results of content determinationin of mannitol（n=4）

2.5 有關物質測定

取甘露醇原料藥（批號分別為FL2005003，E970G，361512014）適量，依法制備有關物質測定用供試品溶液和對照品溶液，分別注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至甘露醇主峰保留時間的3倍，按自身對照法計算雜質的含量。結果見表4。

表4 甘露醇原料藥中有關物質測定結果（%）Tab.4 Results of determinationin of related substances in mannitol API（%）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

常采用氨基柱或強陽離子交換柱對甘露醇進行檢測，但氨基柱柱效下降快，強陽離子交換柱使用柱溫高、適用性差。本研究中采用XBridge Amide色譜柱，該色譜柱采用了化學穩定、三鍵鍵合式的酰胺官能團，為雜化硅膠基質的新型親水色譜柱，適合分析極性化合物，且穩定性更高，使用壽命更長［9-11］。本研究中分別考察了不同流動相比例對測定結果的影響，結果隨著水相比例的增加，甘露醇色譜峰的保留時間不斷縮短，理論板數也不斷增加。綜合考慮分離效果、檢測靈敏度及分析時間，最終選擇乙腈-水（70∶30，V/V）為流動相。

3.2 CAD參數選擇

本研究中分別考察了35℃和55℃兩檔霧化器溫度對檢測結果的影響，結果發現，樣品檢測靈敏度會隨著霧化溫度的增加而升高，故選擇55℃作為霧化器溫度。冪率是CAD檢測器特有的線性校正參數，不同的化合物具有不同的最優冪率。本研究中分別考察了不同的冪率（0.9，1.0，1.1）對甘露醇線性關系的影響，結果發現，隨著冪率的增大，其線性回歸的相關系數也不斷增大，但甘露醇色譜峰的響應也在不斷下降。綜合考慮線性關系和響應的影響，冪率最終選定1.0。

3.3 方法評價

本研究中所建立的HPLC-CAD法操作簡便、快速、靈敏、準確，可用于甘露醇及其制劑中甘露醇的含量測定及質量控制。