基于特征圖譜和含量測定的烏梅丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

許宗穎，車曉彥，包小紅，劉興蘭，張冬梅，陳萌△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.四川省藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611731；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

烏梅丸首見于《傷寒論》，由烏梅、細(xì)辛、干姜、黃連、附子、當(dāng)歸、蜀椒、桂枝、人參、黃柏10味中藥材組方，經(jīng)考證，該方中桂枝為肉桂［1］，人參為黨參［2］。烏梅丸為酸、苦、甘、辛四味配伍，方中烏梅味酸澀，性平，長于滋陰養(yǎng)血，兼能斂肺澀腸；黃連、黃柏味苦，清熱燥濕；細(xì)辛、干姜、附子、蜀椒、肉桂味辛、性溫，溫臟驅(qū)寒止痛；當(dāng)歸、黨參味甘、性平，補(bǔ)養(yǎng)肝血，健脾益氣［3］。臨床常用烏梅丸加減治療慢性復(fù)雜性消化疾病［4-6］。仲景方烏梅丸為生藥搗粉，和以米、蜜，現(xiàn)代有烏梅水丸、大蜜丸、湯劑、散劑。2020年版《中國藥典（一部）》收載的烏梅丸為人參方［7］，目前缺乏經(jīng)典方的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，中藥指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分的含量測定是控制中藥質(zhì)量的有效方法［8-10］。本研究中按原著處方采用飲片打粉制備烏梅丸散劑，建立其特征圖譜和其中5種成分含量測定方法，同時(shí)用該方法對市售藥典方烏梅丸進(jìn)行含量測定，為藥典方烏梅丸（大蜜丸）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相檢測儀（美國沃特世科技＜上海＞有限公司），配有Waters 2489型紫外檢測器，Waters 2998型PDA檢測器；Sartorius BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；Shimadzu UW1020H型電子天平（日本島津公司，精度為萬分之一）；HU20500D型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

枸櫞酸對照品（批號(hào)為100396-201603，純度為100.0%），鹽酸小檗堿對照品（批號(hào)為110713-201804，純度為86.7%），阿魏酸對照品（批號(hào)為110773-201915，純度為99.4%），肉桂酸對照品（批號(hào)為110786-201604，純度為98.8%），鹽酸黃柏堿對照品（批號(hào)為111895-201303，純度為100.0%），β-細(xì)辛醚對照品（批號(hào)為112018-201601，純度為96.8%），α-細(xì)辛醚對照品（批號(hào)為100298-201203，純度為100.0%），6-姜辣素對照品（批號(hào)為111833-201806，純度為99.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；鹽酸黃連堿對照品（成都曼斯特生物科技公司，批號(hào)為MUST-1905211，純度為99.58%）；羥基-α-山椒素對照品（成都麥德生物科技有限公司，批號(hào)為RP200528，純度為98.34%）；黨參炔苷對照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)為PU0058-0010，純度為99.00%）；烏梅丸（散劑，編號(hào)為S1，四川新荷花中藥飲片股份有限公司；編號(hào)為S2，廣州至信中藥飲片有限公司；編號(hào)為S3，四川國強(qiáng)中藥飲片有限公司），涉及藥材飲片產(chǎn)地及批號(hào)見表1；烏梅丸（大蜜丸，規(guī)格均為每丸3 g，云南騰藥制藥股份有限公司，批號(hào)為20210964；昆明中藥廠有限公司，批號(hào)分別為110241和110159）；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

表1 烏梅丸（散劑）及其藥材飲片產(chǎn)地與批號(hào)Tab.1 Produce areas and batch numbers of Wumei Pills（Power）and their decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 烏梅丸（散劑）特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry Shield C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯 度 洗 脫（0～10 min時(shí)1%A，10～20 min時(shí)1%A～12%A，20～30 min時(shí)12%A～20%A，30～40 min時(shí)20%A～30%A，40～50 min時(shí)30%A～40%A，50～60 min時(shí)40%A～70%A，60～70 min時(shí)70%A～20%A，70～75 min時(shí)20%A～1%A，75～78 min時(shí)1%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：27℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：取枸櫞酸對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.69 mg/mL的枸櫞酸對照品貯備液；分別取鹽酸小檗堿、阿魏酸、肉桂酸、鹽酸黃柏堿、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、6-姜辣素、鹽酸黃連堿、羥基-α-山椒素、黨參炔苷對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.20，0.17，0.15，0.40，0.10，0.20，0.14，0.10，1.56，0.68 mg/mL的對應(yīng)成分對照品貯備液。取上述對照品貯備液適量，混勻，即得。

供試品溶液：按仲景方用藥劑量比例，取烏梅肉25 g，黃連16 g，黑順片6 g，黃柏6 g，細(xì)辛6 g，花椒4 g，當(dāng)歸4 g，肉桂6 g，干姜10 g，黨參6 g，混合打粉，過5號(hào)篩，取0.5 g，精密稱定，精密加入50 mL水，稱定質(zhì)量，80℃加熱回流60 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，并補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.1.3 共有峰確定

取烏梅丸（散劑）樣品（編號(hào)分別為S1，S2，S3），依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版）軟件，生成烏梅丸（散劑）高效液相色譜疊加指紋圖譜（圖1）。采用11種混合對照品和藥材分組相結(jié)合的方法對特征峰進(jìn)行歸屬認(rèn)定。10味藥材按照四味進(jìn)行分組，烏梅為酸味組，黃連、黃柏為苦味組，當(dāng)歸、黨參為甘味組，肉桂、花椒、干姜、細(xì)辛、附子為辛味組。確定共有峰為22個(gè)特征峰，指認(rèn)第1，7號(hào)峰歸屬于烏梅（峰1為枸櫞酸），第3，5，6，8，9，10，12，13，14號(hào)峰歸屬于苦味組（峰5為鹽酸黃柏堿，峰12為鹽酸黃連堿，峰14為鹽酸小檗堿），第2，4，15，16號(hào)峰歸屬于甘味組（峰15為阿魏酸，峰16為黨參炔苷），第11，17，18，19，20，21，22號(hào)峰歸屬于辛味組（峰17為肉桂酸，峰19為羥基-α-山椒素，峰20為6-姜辣素，峰21為β-細(xì)辛醚，峰22為α-細(xì)辛醚）。

S1-S3.供試品溶液R.混合對照品溶液圖1 烏梅丸（散劑）特征圖譜S1-S3.Test solution R.Mixed reference solutionFig.1 Characteristic chromatograms of Wumei Pills（Power）

2.1.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1），依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）6份，依法制備供試品溶液，分別于0，4，8，24，26 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果共有峰相對保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3.0%（n=5），表明供試品溶液放置26 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 5種成分含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

枸櫞酸：流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯 度 洗脫（0～10 min時(shí)2%A～5%A，10～15 min時(shí)5%A～8%A，15～17 min時(shí)8%A～2%A，17～20 min時(shí)2%A）。其余同2.1.1項(xiàng)下色譜條件。

鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素：除檢測波長為285 nm外，其余同2.1.1項(xiàng)下色譜條件。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素混合對照品溶液適量，按此色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果各成分的分離度均符合要求。

2.2.2 溶液制備

枸櫞酸對照品溶液：取枸櫞酸對照品69.6 mg，置25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容，得對照品貯備液（質(zhì)量濃度為2.784 mg/mL）。精密量取對照品貯備液，配制成質(zhì)量濃度為0.027 8，0.055 7，0.139，0.278，0.557，1.114，1.670 mg/mL的系列枸櫞酸對照品溶液。

混合對照品溶液：分別取鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素對照品各適量，精密稱定，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為鹽酸黃柏堿9.84 μg/mL、鹽酸黃連堿23.90 μg/mL、黨參炔苷4.04 μg/mL、羥基-α-山椒素9.20 μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液Ⅰ［烏梅丸（散劑）］：同2.1.2項(xiàng)下供試品溶液。

供試品溶液Ⅱ［烏梅丸（大蜜丸）］：取樣品適量，剪碎，取3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL水，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min使完全溶散，80℃加熱回流60 min，放冷至室溫，稱定質(zhì)量，并補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

陰性對照品溶液：取除待測成分藥味外的其余藥味均按處方進(jìn)行混合打粉，分別按2.1.2項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。色譜圖見圖2。可見，陰性對照品溶液無相應(yīng)色譜峰，對樣品中其他組分無影響。

線性關(guān)系考察、定量限與檢測限確定：分別吸取2.2.2項(xiàng)下枸櫞酸對照品溶液、混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。分別取各對照品溶液進(jìn)行稀釋，分別按信噪比為10∶1和3∶1時(shí)的進(jìn)樣量計(jì)算定量限和檢測限。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察和定量限與檢測限確定結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOQ and LOD

5.鹽酸黃柏堿12.鹽酸黃連堿16.黨參炔苷19.羥基-α-山椒素A.供試品溶液ⅠB-E.缺黃柏、黃連、黨參、花椒陰性對照品溶液F.混合對照品溶液圖2 4種成分含量測定高效液相色譜圖（λ=285 nm）5.Phellodendrine chloride 12.Coptisine hydrochloride 16.Lobetyolin 19.Hydroxy-α-sanshoolA.Test solutionⅠB-E.Negative reference solution lacking Phellodendri Chinensis Cortex，Coptidis Rhizoma，Codonopsis Radix and Zanthoxyli Pericarpium F.Mixed reference solutionFig.2 HPLC chromatograms for content determination of four kinds of components（λ=285 nm）

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下枸櫞酸對照品溶液、混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素峰面積的RSD分別為0.31%，1.70%，2.59%，2.10%，0.83%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）適量，依法制備供試品溶液6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果烏梅丸中枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素的平均含量分別為56.47，0.554，2.231，0.054，0.483 mg/g，RSD分別為2.97%，1.98%，1.13%，2.23%，2.88%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液Ⅰ適量，分別于0，4，8，24，48 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果供試品溶液Ⅰ中枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素峰面積的RSD分別為1.68%，1.98%，2.11%，2.72%，2.24%（n=5），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）9份，每份0.25 g，精密稱定，每組3份，置具塞錐形瓶中，精密加入高、中、低濃度的對照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。

表3 烏梅丸（散劑）加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of Wumei Pills/Power（n=9）

耐用性試驗(yàn)：選用2臺(tái)液相色譜儀，選用不同色譜柱［Waters SymmetryShield C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）2根、XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］進(jìn)行含量測定。結(jié)果含量測定結(jié)果的RSD均低于5%，表明耐用性良好。

2.2.4 樣品含量測定

取3批烏梅丸（散劑，編號(hào)分別為S1，S2，S3）和烏梅丸（大蜜丸，批號(hào)分別為20210964，110241，110159），依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（大蜜丸扣除輔料，mg/g）Tab.4 Results of content determination of index components in samples（the amount of excipients is not calculated in the Dami Pills，mg/g）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

分別采用紫外檢測器對每個(gè)對照品進(jìn)行全波長掃描，分別比較了214，240，265，285，318 nm波長下色譜圖的峰數(shù)、峰形等變化。結(jié)果顯示，以214 nm檢測波長所得色譜峰數(shù)目相對較多、峰面積相對較大，故選擇214 nm為特征圖譜檢測波長。枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、黨參、鹽酸黃連堿、羥基-α-山椒素的最大吸收波長分別為214，285，284，266，270 nm。故選擇214 nm為枸櫞酸含量測定波長，285 nm為另外4種成分含量測定波長。在特征圖譜色譜條件下，枸櫞酸與相鄰峰的分離度不好，對流動(dòng)相的梯度比例進(jìn)行了調(diào)整，檢測波長和流動(dòng)相梯度與另外4種成分不同，故單獨(dú)測定。

3.2 指標(biāo)性成分選擇

烏梅含有豐富的有機(jī)酸，如枸櫞酸、蘋果酸等［11］，小檗堿和黃連堿是黃連的重要活性成分［12］，黃柏堿是黃柏的主要活性成分［13］。黃連和黃柏均含鹽酸小檗堿，故選擇黃連堿作為黃連的特征物質(zhì)，黃柏堿作為黃柏的特征物質(zhì)。干姜含有大量揮發(fā)油，6-姜辣素是干姜的活性物質(zhì)，能抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)［14］。揮發(fā)油是細(xì)辛的主要活性物質(zhì)，α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有開發(fā)價(jià)值［15］。羥基-α-山椒素是花椒指紋圖譜中的特征峰［16］。肉桂酸可用于肉桂的質(zhì)量評價(jià)［17］。阿魏酸是當(dāng)歸質(zhì)量控制的檢測物質(zhì)，具有抗炎、調(diào)脂、保肝功效［18］。黨參炔苷是黨參的標(biāo)志性成分，具有胃黏膜保護(hù)作用［19］。故選擇枸櫞酸、鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸黃柏堿、6-姜辣素、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、羥基-α-山椒素、肉桂酸、阿魏酸、黨參炔苷11種對照品對特征圖譜的保留時(shí)間和紫外光譜圖進(jìn)行確認(rèn)，烏梅丸（散劑）含共有峰22個(gè)，確定了11個(gè)成分。因附子中烏頭堿類生物堿所需流動(dòng)相與樣品中其他成分所需流動(dòng)相差異較大，故進(jìn)行復(fù)方各類成分的分析時(shí)未能體現(xiàn)該類成分。

3.3 提取條件選擇

以甲醇和水為提取溶劑，甲醇采用超聲30 min和60 min，與水浴回流60 min進(jìn)行比較，結(jié)果采用回流水提的方法，枸櫞酸的含量最高，檢出的特征峰較多，故選擇水提的方法制備供試品溶液。方中有4味揮發(fā)性藥材，比較了100，80，60℃溫度條件，揮發(fā)性成分羥基-α-山椒素隨溫度升高含量下降，分別為0.35，0.54，0.56 mg/g，故選擇80℃水浴回流。

3.4 樣品含量測定結(jié)果分析

含量測定的指標(biāo)是兼顧中醫(yī)方解烏梅丸的四味制定，酸味組烏梅的枸櫞酸；苦味組黃柏的鹽酸黃柏堿，黃連的鹽酸黃連堿；甘味組黨參的黨參炔苷；辛味組花椒的羥基-α-山椒素。3批烏梅丸（散劑）5種含量測定結(jié)果差異均較大，表明藥材質(zhì)量差異較大。其中，黨參炔苷的含量太低，不建議作為指標(biāo)性成分控制。烏梅丸（大蜜丸）含量測定結(jié)果顯示，不同廠家樣品之間羥基-α-山椒素相差較大，提示《中國藥典（一部）》收載的烏梅丸僅規(guī)定了黃柏和黃連的含量測定，對于烏梅丸的整體質(zhì)量控制較弱。揮發(fā)性成分烏梅丸（散劑）高于大蜜丸，提示在大蜜丸生產(chǎn)工藝中應(yīng)注意防止揮發(fā)性物質(zhì)的損失。

3.5 方法評價(jià)

本研究中建立了烏梅丸（散劑）特征圖譜和5種成分含量測定的高效液相色譜法，對烏梅丸2種劑型進(jìn)行測定，能有效定性、定量控制烏梅丸的活性成分，方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可為藥典方烏梅丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了參考，也為開發(fā)傳統(tǒng)經(jīng)方烏梅丸系列提供了參考。