高效液相色譜法同時(shí)測定前胡藥材中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量*

邱明鳴，朱育鳳，倪昌榮

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

前胡為常用化痰止咳藥，始載于《名醫(yī)別錄》，臨床應(yīng)用歷史悠久，具有降氣化痰、散風(fēng)清熱功效，主要用于治療痰熱喘滿、咯痰黃稠、風(fēng)熱咳嗽痰多等［1］。前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorumDunn的干燥根，含有香豆素類、揮發(fā)油、黃酮、色原酮、苯丙衍生物等化學(xué)成分［2-7］，具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗心腦缺血、抗心衰、抗氧化、降血壓等作用［8-9］。姚蓉等［10］對(duì)湖南市場的前胡藥材進(jìn)行檢測，結(jié)果14批藥材中含量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的僅占35.71%。市售前胡藥材按照2020版《中國藥典（一部）》含量測定方法進(jìn)行檢測，大部分達(dá)不到藥典要求，說明現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)需要改進(jìn)和完善。本研究中收集安徽、浙江、四川、湖南等地產(chǎn)的31批前胡藥材樣品，以白花前胡甲素和白花前胡乙素為指標(biāo)性成分，參考2020年版《中國藥典（一部）》前胡含量測定項(xiàng)下方法，建立了測定上述2種成分含量的高效液相色譜法，為制訂前胡藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有G1312B型二元泵、G1367E型高性能自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G4212B型二極管陣列檢測器、G1322A型脫氣機(jī)；AX224ZH/E型電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司，精度為十萬分之一）；KQ-1000型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

白花前胡甲素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為B20035），白花前胡乙素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)為B20037），均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%；甲醇（色譜純，Merck Lichrosolv Reag.ph eur，批號(hào)為jc20213088）；其他試劑均為分析純，水為純凈水。前胡藥材樣品經(jīng)江蘇省中醫(yī)院朱育鳳主任中藥師鑒定為正品，樣品信息見表1。

表1 31批前胡藥材樣品信息Tab.1 Information of 31 batches of Peucedani Radix samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Eclipse-XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-甲醇（25∶75，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：321 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按白花前胡甲素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，色譜圖見圖1。可見，供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)。

1.白花前胡甲素2.白花前胡乙素A.混合對(duì)照品溶液B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Praeruptorin A 2.Praeruptorin B A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取前胡藥材樣品粉末（過3號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為33 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。取白花前胡甲素標(biāo)準(zhǔn)品1.49 mg和白花前胡乙素標(biāo)準(zhǔn)品1.45 mg，精密稱定，加甲醇5 mL使溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0.298 mg/mL和0.290 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按倍比稀釋法（分別稀釋2倍、10倍、50倍、100倍、625倍）稀釋成系列濃度對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y甲=16 504X甲+9.579 3（r=0.999 8，n=5）和Y乙=15 112X乙+28.403 1（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，白花前胡甲素和白花前胡乙素質(zhì)量濃度分別在3.880 2～248.333 3 μg/mL和1.888 0～120.833 3 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的RSD分別為0.22%和0.15%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20201126）0.5 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的RSD分別為1.37%和1.08%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20201126）0.5 g，精密稱定，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量分別為1.16%和0.15%，RSD分別為0.57%和0.82%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20201126）粗粉（過3號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，共6份，分別加入白花前胡甲素和白花前胡乙素對(duì)照品適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取31批前胡藥材樣品粗粉（過3號(hào)篩）各0.5 g，精密稱定，每批各取3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算干燥樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

本研究中收集的31批前胡藥材樣品來自安徽、浙江、四川、湖南等地，所建立的含量測定方法與2020年版《中國藥典（一部）》前胡含量測定項(xiàng)下方法一致，規(guī)定按干燥品計(jì)算，含白花前胡甲素（C21H22O7）不得少于0.90%，含白花前胡乙素（C24H26O7）不得少于0.24%。由表3可知，31批前胡藥材樣品中，有24批白花前胡甲素含量合格，合格率為77.42%；僅10批白花前胡乙素含量合格，合格率為32.26%；白花前胡甲素和白花前胡乙素含量均合格的僅9批，占29.03%。按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，70.97%的前胡藥材判定為劣藥，不能使用，前胡藥材合格率低，無法滿足臨床用藥需求。

表3 前胡藥材樣品含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of content determination of praeruptorin A and praeruptorin B in the Peucedani Radix samples（%，n=3）

若以2020年版《中國藥典（一部）》前胡含量檢測項(xiàng)下要求的白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量之和（1.14%）為依據(jù)，則有23批合格，占74.19%，合格率大大提高，可緩解臨床用藥問題，故建議《中國藥典（一部）》中以白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量之和1.14%設(shè)限，修訂前胡含量測定項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。類似的不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量的研究還有很多［11-13］，部分研究是在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)問題，并進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。如在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)蓮子心含量合格率低，王協(xié)和等［14］也做了相關(guān)研究，2020年版《中國藥典（一部）》將蓮子心的含量測定成分從蓮心堿修訂為甲基蓮心堿后，蓮子心含量基本能合格。王琦等［15］分析了大孔吸附樹脂和離子交換樹脂在藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用情況，提出《中國藥典》藥品標(biāo)準(zhǔn)中需進(jìn)一步規(guī)范樹脂的使用，以提高標(biāo)準(zhǔn)的可行性。

綜上所述，市售前胡藥材質(zhì)量參差不齊，合格率低，需要一個(gè)切合實(shí)際的質(zhì)量控制方法來評(píng)價(jià)和控制其質(zhì)量，以滿足臨床用藥需求，可為2025年版《中國藥典（一部）》中前胡相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供數(shù)據(jù)支持。