薯蕷皂苷對阿爾茨海默病模型大鼠認知功能的影響*

劉璐，丁力，方曉霞，孫延鵬，陳俊

（湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 十堰 442000）

阿爾茨海默病（AD）為神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆癥最常見的一種形式，全球約有4 500萬人患病［1］，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶功能明顯損傷，無法進行日常獨立活動。同時，AD患者大腦的各個區(qū)域伴隨著病情的進展，會引起進行性神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致腦萎縮［2］。AD的病理特征是細胞外老年斑和細胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）［3］，異常β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集起源于纖維毒性物質(zhì)，加速了AD微管失穩(wěn)、突觸功能障礙、神經(jīng)炎癥等發(fā)病機制，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞丟失而發(fā)病［4］。神經(jīng)炎癥過程伴隨著一系列促炎因子的表達，靜脈注射β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）能顯著促進小鼠腦內(nèi)炎性因子的表達，并激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡［5］。SIRT1對慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激模型大鼠的認知有神經(jīng)保護作用，可通過抑制核因子κB（NF-κB）發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6］。薯蕷皂苷具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗血小板聚集、調(diào)血脂等功效［7］。本研究中基于薯蕷皂苷的免疫調(diào)節(jié)及抗血小板聚集作用探討了其對AD模型大鼠認知功能及SIRT1/NF-κB信號通路的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BX53型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DYCZ-25D型電泳儀（美國Thermo公司）；Sartorius BSA型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.001 g）；伯樂Mini-PRO型熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)儀（美國伯樂公司）；LAS 4000型成像系統(tǒng)（美國GE Healthcare公司）。

試藥：薯蕷皂苷對照品（南京建成生物工程研究所，批號為256294，純度為99.99%）；石杉堿甲（四川普西奧標物科技有限公司，批號為102518-79-6）；Aβ1-42（上海研啟生物科技有限公司，批號為30120-1543，純度為99%）；逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RTqPCR）試劑盒（上海優(yōu)寧維生物有限公司，批號為954641）；蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號為954840）；SIRT1蛋白抗體、NF-κB蛋白抗體、β-actin蛋白抗體（美國Abcam公司，批號分別為5573298，5579624，2011548）。

動物：SPF級12周齡SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（渝）2018-0001，動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-0022，動物質(zhì)量合格證號為00102458。試驗期間所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度為18～25℃、相對濕度為60%～70%的清潔級動物房內(nèi)，自由取食、飲水，自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，符合動物倫理學(xué)要求。

1.2 方法

分組、建模與給藥：按隨機數(shù)字表法將60只SD大鼠分為正常對照組（A組，等量生理鹽水），模型組（B組，等量生理鹽水），石杉堿甲組（C組，0.02 mg/kg）［8］，以及薯蕷皂苷低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，17.5，35.0，70.0 mg/kg）［9］，各10只。取Aβ1-42，溶于磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為4 g/L的Aβ1-42溶液，于37℃溫度下孵育36 h。除A組外，其余各組大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，分別在大鼠海馬區(qū)前囟后3.8 mm、中線旁2.5 mm、前囟下3.0 mm各注射Aβ1-42溶液1 μL［10］，以復(fù)制AD模型大鼠。建模成功后，C組、D1組、D2組、D3組大鼠分別于次日灌胃給予相應(yīng)藥物，A組和B組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每日1次，持續(xù)30 d［9］。

大鼠神經(jīng)功能缺損評分（MNSS）：大鼠AD模型復(fù)制成功后，讓另一實驗外工作人員分別于給藥干預(yù)前1 d和給藥后30 d采用改良MNSS量表對大鼠的運動、感覺、反應(yīng)和平衡能力進行評分，評分越高表示大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴重。0分為無損傷，1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

Morris水迷宮實驗：將水池分為4個象限，大鼠隨機放在1個象限內(nèi)，記錄大鼠找到平臺所用的時間，若60 s內(nèi)未找到平臺，則將大鼠放在平臺上10 s后離開，連續(xù)記錄5 d，每天2次，平均時間為當(dāng)日的最終逃逸時間。第6天，去掉平臺，將大鼠放在任一象限并做好標記，記錄大鼠在標記象限內(nèi)的停留時間和平臺區(qū)域穿越次數(shù)。

大鼠腦組織病理結(jié)構(gòu)觀察：實驗?zāi)┢冢幩来笫螅〈笫笥夷X半球，切取1/2，用生理鹽水漂洗，置甲醛水溶液中固定48 h，取部分腦組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，于顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理結(jié)構(gòu)。

總RNA提取及RT-qPCR檢測：實驗?zāi)┢冢幩来笫螅〈笫笞竽X半球組織0.1 g，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取大鼠腦組織中總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，保存于-80℃，備用。RT-qPCR體系為，SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL，特異性引物2.0 μL，模板cDNA 3.25 μL，DEPC水補足至30 μL；反應(yīng)條件為，95℃、10 min，95℃、10 s，60℃、30 s，70℃、30 s，共40個循環(huán)。設(shè)置3個復(fù)孔，按2-ΔΔCT法計算、分析mRNA表達。

大鼠腦組織SIRT1和NF-κB蛋白水平檢測：新鮮分離的1/2大鼠右腦半球組織用生理鹽水洗凈，取0.1 g，采用放射免疫沉淀分析（RIPA）緩沖液溶解蛋白，離心（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，離心半徑為12 cm）提取蛋白上清液，使各組質(zhì)量濃度為3 μg/mL，蛋白上樣量為10 μL。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，用特異性抗體SIRT1，NF-κB，β-actin于4℃條件下孵育12 h，用1%吐溫-20溶液清洗3次，每次10 min；進行二抗孵育2 h，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次10 min，在LAS 4000型成像系統(tǒng)上顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以X±s表示，采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MNSS量表評分

與A組比較，B組大鼠給藥前1 d和給藥后30 d的MNSS量表評分均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠給藥后30 d的MNSS量表評分均顯著降低（P＜0.05），且D1組、D2組、D3組間效應(yīng)呈劑量依賴性（P＜0.05）；D3組和C組比較無顯著差異（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠MNSS量表評分比較（±s，分，n=10）Tab.1 Comparison of MNSS score in each group（±s，point，n=10）

表1 各組大鼠MNSS量表評分比較（±s，分，n=10）Tab.1 Comparison of MNSS score in each group（±s，point，n=10）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；與D1組比較，dP＜0.05；與D2組比較，eP＜0.05。表2至表4同。Note：Compared with those in group A，aP＜0.05；Compared with those in group B，bP＜0.05；Compared with those in group C，cP＜0.05；Compared with those in group D1，dP＜0.05；Compared with those in group D2，eP＜0.05（for Tab.1-4）.

給藥后30 d 1.65±0.28 6.32±0.42a 3.07±0.31b 5.15±0.53bc 4.17±0.42bcd 3.18±0.32bde 181.31＜0.001組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值劑量（mg/kg）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0給藥前1 d 1.63±0.25 6.52±0.31a 6.69±0.37a 6.56±0.44a 6.55±0.38a 6.57±0.36a 321.10＜0.001

2.2 大鼠Morris水迷宮實驗

與A組比較，B組大鼠逃逸時間顯著延長，目標象限停留時間顯著縮短，平臺區(qū)域穿越次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠逃逸時間均顯著縮短，目標象限停留時間均顯著延長，平臺區(qū)域穿越次數(shù)均顯著增加，且D1組、D2組、D3組間效應(yīng)呈劑量依賴性（P＜0.05）；D3組和C組比較無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠逃逸時間、目標象限停留時間、平臺區(qū)域穿越次數(shù)比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of escape time，residence time in the target quadrant and crossing times in the platform area in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠逃逸時間、目標象限停留時間、平臺區(qū)域穿越次數(shù)比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of escape time，residence time in the target quadrant and crossing times in the platform area in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值劑量（mg/kg）逃逸時間（s）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0第1天33.12±3.51 41.57±3.92a 35.48±3.59b 39.29±4.01 37.97±3.88 35.52±3.61b 6.58＜0.001第2天27.32±2.46 39.55±4.02a 29.75±3.02b 37.10±3.87c 34.23±3.54c 29.88±3.06bd 20.02＜0.001第3天18.16±1.21 30.12±3.11a 20.11±2.21b 27.58±2.89c 24.82±2.84bc 20.31±2.42bd 35.22＜0.001第4天13.54±1.29 30.01±3.12a 14.07±1.98b 26.51±2.54c 22.14±2.31bc 14.11±1.92bde 100.82＜0.001第5天10.33±1.30 25.93±2.59a 11.00±1.31b 20.33±2.15bc 15.75±1.04bcd 11.12±1.23bde 137.08＜0.001目標象限停留時間（s）24.14±2.21 12.09±1.51a 23.77±2.32b 16.52±1.87bc 19.74±1.85bcd 23.61±2.15bde 59.35＜0.001平臺區(qū)域穿越次數(shù)（次）4.11±0.35 1.73±0.21a 4.02±0.38b 2.43±0.29bc 3.25±0.31bcd 3.92±0.34bde 94.21＜0.001

2.3 大鼠腦組織病理結(jié)構(gòu)

A組大鼠腦組織細胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，未見出血及水腫；B組大鼠細胞排列松散，部分細胞點狀壞死，細胞邊界不清，大量炎性細胞浸潤，出血和水腫明顯；C組、D1組、D2組、D3組大鼠腦組織出血減輕，水腫面積縮小，細胞點狀壞死數(shù)量減少，且其效應(yīng)呈劑量依賴性。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理結(jié)構(gòu)（HE染色，×200）Fig.1 Pathological structures of brain tissues of rats in each group（HE staining，×200）

2.4 大鼠腦組織中SIRT1與NF-κB mRNA和蛋白表達水平

與A組比較，B組大鼠腦組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，NF-κB mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠腦組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，NF-κB mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，且D1組、D2組、D3組間效應(yīng)呈劑量依賴性（P＜0.05）；D3組和C組比較無顯著差異（P＞0.05）。詳見表3、表4和圖2。

圖2 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB蛋白表達電泳圖Fig.2 Electropherograms of SIRT1 and NF-κB proteins in brain tissues of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB mRNA表達水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of SIRT1 and NF-κB mRNA expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB mRNA表達水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of SIRT1 and NF-κB mRNA expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值NF-κB mRNA 0.20±0.08 0.76±0.17a 0.30±0.10b 0.61±0.12bc 0.43±0.10bcd 0.31±0.11bde 33.06＜0.001劑量（mg/kg）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0 SIRT1 mRNA 0.75±0.21 0.22±0.09a 0.71±0.17b 0.35±0.12bc 0.52±0.15 bcd 0.69±0.18bde 18.70＜0.001

表4 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB蛋白表達水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of SIRT1 and NF-κB proteins expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

表4 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB蛋白表達水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of SIRT1 and NF-κB proteins expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值劑量（mg/kg）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0 SIRT1/β-actin 0.87±0.20 0.23±0.11a 0.73±0.15b 0.37±0.14bc 0.55±0.17bcd 0.72±0.19bde 22.14＜0.001 NF-κB/β-actin 0.21±0.15 0.90±0.22a 0.32±0.17b 0.67±0.19bc 0.48±0.16bcd 0.36±0.12bde 22.16＜0.001

3 討論

認知功能障礙是人體學(xué)習(xí)記憶和思維判斷出現(xiàn)不同程度的異常現(xiàn)象，可引起嚴重的學(xué)習(xí)和記憶障礙，病情嚴重時可能導(dǎo)致失語、失用等［11］。人類大腦功能的正常運行是認知功能正常的基礎(chǔ)，當(dāng)大腦功能的結(jié)構(gòu)受到其他因素影響而導(dǎo)致其發(fā)生異常改變時，可引起機體發(fā)生認知功能障礙［12］。認知功能障礙診斷極為困難，大腦結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人體認知功能由多種結(jié)構(gòu)構(gòu)成，一個或幾個方面產(chǎn)生的異常均可能引起認知功能障礙［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在復(fù)制AD模型大鼠后，大鼠MNSS量表評分均顯著升高，同時大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力均顯著降低，表明大鼠神經(jīng)功能受損；經(jīng)薯蕷皂苷干預(yù)后，大鼠MNSS量表評分均顯著降低，學(xué)習(xí)能力和記憶能力均顯著提高，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，進一步提示了薯蕷皂苷具有神經(jīng)保護作用，對AD模型大鼠具有一定的治療效果。

為了解薯蕷皂苷改善AD模型大鼠認知功能障礙的具體作用機制，本研究中初步探討了薯蕷皂苷對SIRT1/NF-κB信號通路的影響。SIRT1是AD中維持細胞免疫平衡的關(guān)鍵翻譯因子［14］，可參與神經(jīng)調(diào)節(jié)，并在神經(jīng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用［15］。激活SIRT1表達可增強海馬神經(jīng)功能，從而逆轉(zhuǎn)不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病所引起的認知缺陷［16］。黃酮類化合物可進一步促進SIRT1的轉(zhuǎn)運，并在AD模型大鼠中提供神經(jīng)保護［17］。薯蕷皂苷也是一種生物活性黃酮類化合物，在體內(nèi)外具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，與SIRT1/NF-κB通路的激活有關(guān)［18］。當(dāng)AD模型大鼠出現(xiàn)認知功能障礙時，SIRT1表達受到抑制，SIRT1 mRNA和蛋白均呈現(xiàn)低表達，而NF-κB mRNA和蛋白均呈現(xiàn)高表達，高表達的NF-κB可引起機體炎性反應(yīng)進一步加重，從而使大鼠認的知功能發(fā)生障礙［19］。本研究中，經(jīng)薯蕷皂苷干預(yù)后，大鼠SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均升高，而NF-κB mRNA和蛋白表達水平均降低，其原因可能是薯蕷皂苷可刺激機體SIRT1的表達，從而靶向抑制NF-κB的表達，延緩機體炎性反應(yīng)的發(fā)生，起到改善大鼠認知功能的作用。

本研究存在以下局限性，認知功能的影響是多因素共同作用的結(jié)果，可能還有其他信號通路的參與，后續(xù)將探討更多作用機制；由于薯蕷皂苷是一種多靶點藥物，具有抗氧化、抗炎等多種神經(jīng)保護作用，而本研究中薯蕷皂苷的神經(jīng)保護作用是否與其抗氧化或其他性質(zhì)有關(guān)尚未討論，后續(xù)將進一步研究。

綜上所述，薯蕷皂苷可有效改善AD模型大鼠的認知功能障礙，其機制可能為通過促進機體SIRT1表達和靶向抑制NF-κB表達，從而逆轉(zhuǎn)機體免疫平衡紊亂。