地龍膠囊聯合放療對喉鱗癌裸鼠移植瘤血管生成的抑制作用

張瑞芳，侯繼崇，張玲娟

（1.衡水市人民醫院，河北衡水 053000；2.衡水市第七人民醫院，河北衡水 053000；3.邢臺市第三醫院，河北邢臺 054000）

喉鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。流行病學調查發現，大部分喉鱗癌患者在進行手術聯合放療輔助治療后都面臨著復發和轉移的風險，這是因為喉鱗癌中晚期患者的癌細胞對放療的抵抗能力上升，使放療的治療效果降低所致，呈現喉鱗癌5年生存率持續下降，并且伴隨著喉鱗癌患者年輕化的現狀[1]。因此，尋找一種有效藥物輔助放療來提高喉鱗癌患者的生存率至關重要。地龍膠囊由地龍、川芎、黃芪、牛膝等多種中藥組成，具有增強免疫功能、抑制腫瘤細胞生長等功效[2]。相關文獻研究[3]發現，地龍膠囊能夠有效抵抗腫瘤侵襲，其作用機制可能與其加快血流速度、改變血液黏稠度等有關。本研究觀察地龍膠囊聯合放療對人喉鱗癌荷瘤裸鼠瘤體生長的影響及機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級純系裸鼠40只，雌雄各半，4.8周齡，購自上海斯萊克實驗動物公司，動物質量合格證號：SCXK（滬）2017-0036。本實驗在衡水學院動物學實驗室完成。飼養環境溫度為24℃左右，濕度為65%左右，自由飲食。

1.2 細胞來源及培養人喉鱗癌Hep-2細胞株，購自上海慧穎生物公司。以含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液在5%CO2、37℃、飽和濕度的培養箱中培養。

1.3 藥物、試劑與儀器地龍膠囊（南京恒生制藥公司生產，批號：國藥準字Z19991007，規格：0.28 g/粒）。血小板內皮細胞黏附分子1（PECAM-1，CD31）試劑盒（武漢菲恩生物科技公司）；生存素（survivin）抗體（上海瓦蘭生物公司）；缺氧誘導因子1α（HIF-1α）抗體（上海極威生物公司）；生存素免疫組織化學檢測試劑盒（上海莼試生物公司）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（自北京伊塔生物）。組織切片機（湖北孝感闊海醫療科技）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BY-600C離心機（北京白洋生物公司）；COGZ-250型CO2培養箱（常州金壇良友儀器公司）；電泳儀（北京柏奧易杰科技公司）。

1.4 喉鱗癌裸鼠模型的建立與分組將裸鼠背部用不同顏料做好標記，用醫用酒精對裸鼠背部進行消毒處理，將濃度為1×108個/mL的人喉鱗癌hep-2細胞注射于裸鼠背部皮下，每只裸鼠注射0.18 mL，注射完畢后，按壓注射部位10 s。7 d后成瘤。將40只成瘤裸鼠隨機分為4組，即模型組、放療組、地龍膠囊組、聯合組，每組10只。

1.5 治療方法放療組：采用γ射線局部照射裸鼠移植瘤（225倫/min，周一到周六每天照射2 Gy，周日休息，共進行12 d，共24 Gy；地龍膠囊組：給予地龍膠囊混懸液50 mg·kg-1·d-1[4]灌胃，連續干預2周；聯合組：地龍膠囊聯合放療共同進行治療，方法同地龍膠囊組和放療組。模型組：給予等體積生理鹽水灌胃，連續干預2周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 瘤體質量與體積 用擊打法處死實驗裸鼠，并在其背部取瘤。在5 mL注射器中加入3 mL滅菌注射用水，取瘤稱質量后快速轉移到注射器內，運用阿基米德定律，液面上升的高度就是取出的瘤體的體積。利用注射器數值及刻度尺進行讀數，進行拍照存檔。

1.6.2 免疫熒光染色法測定喉鱗癌細胞移植瘤CD31表達及微血管密度（MVD）將移植瘤組織冷凍制成5μm厚的切片，滴加血清封閉，25℃孵育30 min。滴加1%熒光標記的CD31抗體，25℃孵育2 h，緩沖液沖洗3次（共30 min）。加入山羊抗兔IgG二抗，避光孵育1 h。PBS沖洗3次后，顯色，封片。顯微鏡下隨機選取5個視野計數單位面積的毛細血管數或單位體積的毛細血管數，即MVD。CD31抗體免疫熒光染色將血管內皮細胞染成紅色。

1.6.3 免疫組織化學法檢測移植瘤組織生存素（survivin）的表達 將瘤體取出后，脫水、石蠟包埋和制片，脫蠟和水化，抗原修復，消除內源性過氧化物酶活性，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，復染、脫水、透明和封片。生存素陽性染色位于細胞核和細胞漿，顯微鏡下隨機選取5個視野計數生存素陽性細胞率。

1.6.4 蛋白免疫印跡法檢測移植瘤組織中HIF-1α表達 稱取移植瘤組織，充分裂解提取總蛋白，按照二喹啉甲酸（BCA）試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度，根據所測定的蛋白濃度決定上樣量。依次按配膠、電泳、轉膜、封閉的順序，使提取的蛋白與目的蛋白抗體結合并免疫雜交，最后將雜交產物條帶放入Tanon 5200 Multi成像系統中進行顯影成像，分析目的蛋白條帶灰度值，以β-actin條帶灰度值為內參，計算目標蛋白灰度值/內參灰度值比值。重復實驗4次。

1.7 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析或重復測量分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠移植瘤質量、體積比較圖1結果顯示，與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠瘤體質量和體積均有所降低，其中，聯合組的差異有統計學意義（P＜0.05），表明地龍膠囊聯合放療對裸鼠喉鱗癌移植瘤生長有明顯抑制作用，優于單用放療或地龍膠囊。

圖1 各組裸鼠移植瘤質量、體積比較Figure 1 Comparison of mass and volume of transplanted tumor between various groups of nude mice

2.2 各組裸鼠移植瘤組織CD31表達及微血管密度（MVD）比較模型組、放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤CD31陽性細胞數分別為（167±21）、（133±16）、（119±17）、（84±13）個。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤CD31陽性表達水平均降低（P＜0.05），其中，放療組與地龍膠囊組CD31水平無明顯差異（P＞0.05），聯合組裸鼠移植瘤CD31水平低于放療組和地龍膠囊組（P＜0.05）。

模型組、放療組、地龍膠囊組、聯合組MVD分別為（50.9±5.4）、（34.6±3.8）、（37.4±4.6）、（26.2±2.9）個。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤MVD均降低（P＜0.05），其中，放療組MVD與地龍膠囊組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），聯合組MVD水平低于放療組和地龍膠囊組（均P＜0.05）。免疫熒光染色結果見圖2。

2.3 各組裸鼠移植瘤組織生存素表達比較模型組、放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤組織生存素陽性細胞率分別為（83.76±15.73）%、（60.14±7.71）%、（63.11±9.21）%、（20.01±4.28）%。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠生存素陽性細胞率均降低（P＜0.05）；放療組、地龍膠囊組生存素陽性細胞率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；聯合組裸鼠生存素陽性細胞率明顯低于放療組、地龍膠囊組（P＜0.05）。生存素陽性表達情況見圖3。

圖2 各組裸鼠移植瘤CD31表達及微血管密度（MVD）比較（免疫熒光法，×400）Figure 2 Comparison of CD31 expression and microvascular density（MVD）in transplanted tumor tissues between various groups of nude mice（by immumofluorescence method，×400）

圖3 各組裸鼠移植瘤組織生存素陽性細胞分布情況比較（SP免疫組織化學法，×400）Figure 3 Comparison of distribution of survivin-positive cells in transplanted tumor tissues between various groups of nude mice（by SP immunohistochemistry，×400）

2.4 各組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白表達比較模型組、放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白相對表達量分別為（1.56±0.19）、（1.23±0.15）、（1.19±0.12）、（0.85±0.09）。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠HIF-1α蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；放療組、地龍膠囊組HIF-1α蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；聯合組裸鼠HIF-1α蛋白表達水平低于放療組、地龍膠囊組（P＜0.05）。結果見圖4。

3 討論

喉鱗癌可歸屬于中醫學“喉蕈”“喉痹”“鎖喉瘡”范圍。喉位居五臟之上，內通于肺，聯于胃，參與司呼吸，主受納，巧發聲的功能活動。喉鱗癌的發生主要與邪毒外犯、年老體虛、肺胃熱盛等因素有關。地龍膠囊方中，地龍清肺熱、通絡平喘，川芎活血化瘀，黃芪可益氣固表、托毒，牛膝逐瘀通經，共奏清熱毒、活血化瘀的功效。本研究應用地龍膠囊聯合放療治療喉鱗癌裸鼠，觀察其對喉鱗癌裸鼠腫瘤生長情況的影響，結果顯示：模型組裸鼠瘤體質量和體積最大；與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠瘤體質量和體積均有所降低；地龍膠囊組裸鼠瘤體質量及體積與放療組比較，差異無統計學意義；聯合組裸鼠瘤體質量和體積較放療組和地龍膠囊組均顯著降低。表明地龍膠囊聯合放療進行干預能夠抑制喉鱗癌裸鼠移植瘤的進一步擴大，而單純依靠放療和單純灌胃地龍膠囊抑瘤效果較差。

圖4 各組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白表達比較Figure 4 Comparison of HIF-1αprotein expression in transplanted tumor tissues between various groups of nude mice

抑制瘤體內皮細胞血管生成，可有效控制癌細胞的增殖與轉移[5]。本研究結果顯示：聯合組喉鱗癌裸鼠移植瘤CD31表達水平及MVD低于模型組、放療組和地龍膠囊組。本研究通過體內實驗進一步證實了地龍膠囊能夠抑制喉鱗癌裸鼠內皮細胞的血管生成。

生存素是一種僅在腫瘤和胚胎組織中表達的凋亡抑制蛋白，其在腫瘤細胞中呈現特異性的表達。有研究[6]發現，生存素在喉鱗癌中呈現異常的高表達。生存素的過量表達能夠幫助腫瘤細胞躲避細胞周期檢測，促使喉鱗癌細胞增殖，減少凋亡率[7]。而生存素在健康人體內組織中呈低表達，則被認為是腫瘤基因療法的重要靶基因[8]。喉癌組織中生存素表達水平較高，生存素表達與喉癌的發生、發展及浸潤轉移有關，對喉癌的早期診斷，預后判斷具有意義[9]。本研究結果顯示，與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤組織生存素陽性細胞率均降低，其中，聯合組生存素的陽性表達率較放療組、地龍膠囊組下降幅度更明顯，表明地龍膠囊聯合放療能夠降低喉鱗癌裸鼠移植瘤組織生存素的陽性高表達，進而促進喉癌細胞凋亡，抑制其增殖，從而減緩瘤體的增長。

研究[10]發現，HIF-lα在喉癌中呈高表達。HIF-1α是缺氧環境中血管生成的重要調控因子。腫瘤細胞的快速生長往往使機體處于低氧環境，從而誘導HIF-1α高表達。多項研究證實，HIF-1α可介導血管內皮生長因子（VEGF）的上調，VEGF可以促進腫瘤的侵襲和遷移，同時，HIF-1α還可調控血小板源生長因子B、促血管生成因子等多種因子[11-14]。HIF-1α的高表達可促進血管形成和腫瘤的生長、凋亡。本研究結果顯示，與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯合組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白表達水平均降低，其中，聯合組HIF-1α蛋白表達低于放療組、地龍膠囊組，表明地龍膠囊聯合放療可通過抑制喉鱗癌裸鼠移植瘤HIF-1α的表達，抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，地龍膠囊聯合放療對喉鱗癌裸鼠瘤體生長具有明顯的抑制作用，其機制可能與抑制腫瘤血管生成，促進細胞凋亡有關。提示地龍膠囊具有輻射增敏的效果，能夠有效降低HIF-1α對放療的抵抗作用。