補腎益精法經外泌體途徑對系統性硬皮病的血管保護作用研究

朱珂，謝頌苗，楊海詩，朱佳玲，李東海，齊慶

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；2.深圳市龍崗中心醫院，廣東深圳 518116；3.東莞市中醫院，廣東東莞 523000；4.廣州醫科大學附屬第二醫院，廣東廣州 510260）

系統性硬皮病（systemic scleroderma，SSc）是一種以多器官進行性纖維化為主要表現的臨床疾病，發病機制尚不明確，主要與血管損傷、免疫異常及纖維化有關[1]。血管損傷發生在SSc疾病的早期，血管損傷的范圍和程度直接影響疾病的進展及預后。補腎益精中藥復方是基于國醫大師鄧鐵濤教授“肺脾腎相關論”而擬定的方劑，具有補腎益精、健脾潤肺、活血化瘀的功效。前期臨床及基礎研究[2-4]發現，補腎益精中藥復方可減輕SSc患者皮膚纖維化，改善患者微循環障礙，具有抑制纖維化及保護血管的療效。外泌體（exosome）是一種直徑為30～150 nm的胞外囊泡，其通過轉運蛋白及核酸等物質實現細胞間的物質及信息交換，是一種細胞之間非接觸的新型通訊方式[5]。外泌體攜帶的內容物和功能可隨分泌細胞及所處微環境的變化而變化，其介導的信息傳遞是中藥發揮藥理效應的重要途徑。內皮細胞的損傷及功能障礙是SSc血管損傷的中心環節[6]，內皮細胞釋放的外泌體可以在一定程度上影響血管的修復及再生。中醫藥對SSc的治療作用是基于其對細胞功能及機體微環境的調節來實現的，探究補腎益精中藥復方能否通過影響血管內皮細胞來源的外泌體的功能發揮對SSc血管損傷的治療作用，對其臨床應用及進一步的機制研究具有重要意義?，F將本研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠20只，6～8周齡，體質量（190±5）g，購于廣東省醫學實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK（粵）2013-0002。SPF級雌性C57BL/6J小鼠30只，6～8周齡，體質量（20.0±1.5）g，購自中山大學實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK（粵）2011-0029。

1.2 細胞株人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），來源于中山大學實驗動物中心細胞庫。

1.3 實驗藥物補腎益精中藥復方，由阿膠10 g、山萸肉10 g、黃芪30 g、茯苓15 g、淮山藥30 g、熟地黃20 g、川紅花5 g組成，所有中藥材均購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。制備：用1 200 mL蒸餾水浸泡復方20 min，煮沸45 min后，收集過濾后的藥液，100℃水浴蒸發濃縮至134 mL（相當于含生藥量0.9 g/mL）。

1.4 主要試劑與儀器TRIzol試劑（美國MRC公司）；血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）、白細胞表面分化抗原（CD）81、CD63多克隆抗體（美國Abcam公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；Matrigel基質膠（上海聯碩生物科技有限公司）；博來霉素粉劑（Aladin公司）；鼠抗血管生成素1（ANG-1）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、血管性假血友病因子（vWF）、CD31等一抗，兔抗鼠二抗[Rabbit Anti-Mouse IgG（H+L）-UNLB]（北京百奧博萊科技有限公司）。EPS-300電泳儀（天能公司）；NICOMP 380DLS納米粒徑分析儀（美國PSS公司）；JJ-12J病理組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；JB-P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）；NIKONECLIPSEE100正置光學顯微鏡、NIKONDSU3成像系統（日本尼康公司）。

1.5 體外研究

1.5.1 大鼠血清制備 將10只SD大鼠分為藥物干預組和對照組。藥物干預組：按大鼠實際體質量計算給藥量，每100 g體質量給予相當于1.8 g生藥量的補腎益精中藥復方藥液灌胃，每日1次，連續7 d。對照組：給予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續7 d。2組大鼠末次給藥3 h后，嚴格在無菌條件下腹主動脈采血，離心，分離制備補腎益精中藥復方含藥血清和對照血清，-80℃冰箱保存備用。

1.5.2 細胞的培養和分組 用無血清DMEM-H培養基（10%FBS，1%P/S，pH=7.0～7.5）在37℃、5%CO2條件下傳代培養HUVEC細胞。將細胞分為2組，分別加入“1.5.1”項藥物干預組、對照組的大鼠血清培養48 h。

1.5.3 外泌體的分離、提取 收集HUVEC細胞培養基上清液，超速離心法分離提取外泌體。實驗離心全程4℃，2 000×g離心30 min，去除死細胞，10 000×g離心45 min，去除細胞碎片。0.45μm一次性濾器收集上清，以100 000×g離心70 min，棄上清，沉淀，重懸，分裝，最后置于-80℃冰箱保存。

1.5.4 外泌體的鑒定 ①透射電鏡觀察外泌體形態：將獲得的外泌體沉淀置于含體積分數為2%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（PBS）中混懸，取混懸液置于電鏡銅網，干燥后以1%戊二醛固定，用0.4%醋酸雙氧鈾染色，甲基纖維素和醋酸雙氧鈾混合物染色并包被，置于透射電鏡下拍照觀察外泌體的形態。②Nano Analyzer法檢測外泌體徑粒與濃度：取5μL外泌體懸液稀釋到30μL，標準品進行儀器性能測試合格后，使用外泌體樣品上樣，獲得Nano Analyzer儀器檢測的外泌體粒徑和濃度信息。③Western Blot法檢測外泌體標志物CD63、CD81和腫瘤易感基因（TSG101）表達：外泌體混懸液中加入Running buffer后變性，電泳，轉膜，孵育抗體，電化學發光（ECL）A/B混合液顯影成像。

1.5.5 HUVEC細胞增殖和成管能力的測定 將HUVEC細胞分為2組，以DMEM-H無血清培養基培養48 h后，分別加入對照血清干預后HUVEC來源的外泌體和補腎益精中藥復方含藥血清干預后HUVEC來源的外泌體，作為對照血清-外泌體組和含藥血清-外泌體組，24 h后觀察2組HUVEC增殖情況。HUVEC增殖能力檢測：40 g/L多聚甲醛固定HUVEC后，取預冷的PBS漂洗3次，加入3 mL Triton X-100；經過3次PBS漂洗后再用5%山羊血清封閉，孵育一抗CD31（1∶200），4℃過夜；孵育二抗后PBS漂洗，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），暗室孵育；PBS漂洗，暗室中滴加抗熒光淬滅劑，共聚焦顯微鏡下觀察采集的圖像。HUVEC成管能力檢測：48孔板中加入100μL預冷的Matrigel基質膠，靜置30 min使膠凝固，將消化后的HUVEC懸液濃度調整到2×105個/mL，每孔加入200μL細胞懸液，孔板蓋上蓋子，放入培養箱培養，每隔一段時間拍照記錄實驗結果。

1.6 體內研究

1.6.1 SSc小鼠造模及外泌體療效觀察 實驗分組及處理：30只雌性C57BL/6J小鼠，隨機分為3組，每組10只，各組小鼠均選取背部中央（1 cm×1 cm）剃去毛發。①正常組：每日以100μL生理鹽水，定點皮下注射，每天1次，共28 d；②SSc小鼠模型組：每日定點皮下注射100μL·mg-1·d-1博來霉素，每日1次，共28 d，并在第1、7天，額外皮下注射50μL外泌體溶液（PBS溶劑）；③外泌體治療組：每日定點皮下注射100μL·mg-1·d-1博來霉素，每日1次，共28 d，并在第1、7天，皮下注射補腎益精中藥復方含藥血清干預后HUVEC來源的外泌體懸液50μL。4周后處死小鼠，分離收取注射區皮膚組織進行進一步的檢測。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠皮膚組織病理變化 分離小鼠注射處皮膚組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，HE染色，脫水，透明及封片，顯微鏡下觀察，并采集圖像及分析。

1.6.3 免疫組織化學染色法檢測小鼠皮膚內皮細胞ANG-1、VEGF、vWF、CD31表達情況 將小鼠皮膚標本制成石蠟切片，常規脫蠟、水化、抗原修復，加一抗，PBS漂洗3次，加二抗后PBS漂洗3次，DAB顯色后在顯微鏡下觀察，乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察。

1.7 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體的提取與鑒定結果將所提取的外泌體置于透射電鏡下觀察，可見大小不等的圓形或類圓形高亮膜性微囊泡，見圖1-A（箭頭所示即為外泌體）。納米顆粒示蹤分析（NTA）法測量外泌體粒徑-濃度分布：x軸及y軸分別表示外泌體的大小、密度，平均粒徑為96.6 nm，中位數粒徑為82.3 nm，粒子個數為6.9×107，粒徑主峰為76.2 nm，主峰所占百分比為98.1%。NTA結果顯示，外泌體直徑30～150 nm，平均約為96.6 nm，濃度為1.4×1013個/mL，見圖1-B。Western Blot結果顯示，所提取外泌體的標志物TSG101、CD81、CD63呈高表達，見圖1-C。

2.2 補腎益精法通過外泌體途徑對HUVEC成管能力的影響補腎益精中藥復方含藥血清組內皮細胞在3 h的成管分支數目對比對照血清組無顯著性差異（P=0.782），4、7 h的成管表現優于對照血清組，分支數目多于對照血清組，差異有統計學意義（P=0.009，P=0.042）。具體結果見圖2-A、圖2-B。補腎益精中藥復方含藥血清組HUVEC在4、7 h的小管長度高于對照血清組，差異有統計學意義（P=0.022，P=0.034），表明補腎益精中藥復方含藥血清成管能力優于對照血清。結果見表1。相對于對照血清-外泌體組，含藥血清-外泌體組的HUVEC成管較早，小管長度及分支數目高于對照血清-外泌體組，但對照血清-外泌體組和含藥血清-外泌體組的HUVEC的成管表現均不及補腎益精中藥復方含藥血清干預組顯著。結果見圖3。

圖1 電鏡下外泌體超微結構（A）、納米顆粒示蹤分析（NTA）結果（B）和外泌體標志物Western Blot電泳條帶（C）圖Figure 1 Electron microscopic ultrastructure of exosomes（A），nanoparticle tracking analysis（NTA）results（B）and Western Blot bands of exosome markers（C）

2.3 補腎益精法通過外泌體途徑對HUVEC增殖能力的影響細胞免疫熒光染色結果顯示，補腎益精含藥血清組HUVEC的CD31的表達較對照血清組顯著增強，具體結果見圖4。含藥血清-外泌體組HUVEC的CD31的表達較對照血清-外泌體組顯著增強，結果見圖5。

2.4 補腎益精法通過外泌體途徑對SSc小鼠皮膚血管損傷的影響正常組小鼠皮膚內膠原纖維含量及膠原間隙正常，皮膚內可見正常數量及結構血管；模型組小鼠皮損區域膠原纖維增粗且排列緊密，血管數量減少，管腔狹窄；與模型組比較，外泌體治療組小鼠皮膚內膠原纖維含量有所減少，膠原間間隙有所增寬，血管數量增多，管腔結構正常。結果見圖6。與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織ANG-1、VEGF、vWF及CD31表達水平明顯降低；外泌體治療組小鼠皮膚組織ANG-1、VEGF、vWF、CD31表達水平顯著高于模型組，較正常組有所降低。結果見圖7。

圖2 對照血清組與含藥血清組HUVEC的成管能力Figure 2 The tube-forming ability of HUVEC in the control serum group and drug-containing serum group

表1 對照組血清與含藥血清組HUVEC小管長度的比較Table 1 Comparison of the length of HUVEC tubules in the control serum group and drug-containing serum group（±s，mm；n=3）

表1 對照組血清與含藥血清組HUVEC小管長度的比較Table 1 Comparison of the length of HUVEC tubules in the control serum group and drug-containing serum group（±s，mm；n=3）

①P＜0.05，與對照血清組比較

組別對照血清組含藥血清組3 h 29 449.33±901.16 29 681.00±1 010.38 4 h 32 420.33±1 425.94 35 934.00±885.11①7 h 31 663.67±1 377.95 34 520.67±732.31①

圖3 對照血清-外泌體組與含藥血清-外泌體組HUVEC的成管能力（×200）Figure 3 The tube-forming ability of HUVEC in the controlserum-exosome group and drug-containing serum-exosome group（×200）

圖4 對照血清組與含藥血清組HUVEC的CD31表達（免疫熒光染色，×200）Figure 4 The CD31 expression in HUVEC in the controlserum group and drug-containing serum group（by immunofluorescence staining，×200）

圖5 對照血清-外泌體組與含藥血清-外泌體組HUVEC的CD31表達（免疫熒光染色，×400）Figure 5 The CD31 expression in HUVEC in the controlserum-exosome group and drug-containing serum-exosome group（by immunofluorescence staining，×400）

圖6 各組小鼠皮膚組織病理形態比較（HE染色，×200）Figure 6 Comparison of the histopathologicalmorphologicalfeatures of the skin tissues between various groups of mice（by HE staining，×200）

3 討論

系統性硬皮?。⊿Sc）是一種少見、難治的自身免疫性疾病，發病機制主要與免疫異常、纖維化和血管病變有關。硬皮病歸屬于中醫學“痹證”范疇，國醫大師鄧鐵濤教授認為“肺脾腎氣陰不足，五臟俱虛”是本病的重要病機[7]，治療應以肺脾腎同治、補腎益精為主。補腎益精中藥復方是本課題組根據鄧鐵濤教授辨治硬皮病思路制定的SSc臨床治療方劑，全方以補腎益精為主，兼以健脾潤肺。血管病變發生于SSc早期，其中，內皮細胞的損傷與功能障礙是血管病變的中心環節。血管微環境的變化可激活轉化生長因子（TGF）-β1信號通路誘發血管內皮細胞間質轉化（EndMT），進而產生過量的膠原蛋白及細胞間質，導致組織和器官纖維化[8]。我們前期研究發現，補腎益精中藥復方可通過干預Fli1表達調控TGF-β信號抑制SSc血管內皮細胞EndMT，可通過拮抗Snail介導的EndMT所參與的纖維增生性閉塞性血管損傷發揮血管保護作用[9-10]。在前期研究基礎上，本研究進一步探討并證實了補腎益精中藥復方可基于對血管微環境與外泌體功能的調節作用治療SSc血管損傷。

圖7 各組小鼠皮膚組織ANG-1、VEGF、vWF、CD31陽性表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 7 Comparison of positive expression of ANG-1，VEGF，vWF and CD31 in skin tissues between various groups of mice（by Immunohistochemistry，×200）

現代醫學與中醫學對腎、髓、血、脈之間聯系的認識基本一致。中醫認為“腎主骨，生髓主腦，髓生血”。現代醫學認為，血管內皮祖細胞、造血干細胞等與血管生成關系密切的功能細胞是由骨髓化生而來?，F代藥理學研究提示，補腎中藥可通過促進血管內皮祖細胞轉化為血管內皮細胞，進而促進血管修復與新生[11]。可見，“腎”在血管形成及血液生成方面起著重要作用。有學者在研究補腎復方與血管生成相關實驗的基礎之上提出“補腎生脈”之說[12]，認為“補腎生脈”的過程中，內皮祖細胞可能起到關鍵的橋梁作用。本研究中，我們也觀察到，補腎益精中藥復方促進SSc血管修復之功效可通過直接影響內皮細胞功能或經內皮細胞源性外泌體的介導來實現，可見，內皮細胞的功能狀態是決定補腎益精中藥復方治療SSc血管損傷療效的關鍵因素。

外泌體是由細胞分泌的一種攜帶蛋白、RNA等多種活性物質的胞外囊泡，可介導細胞間通訊，調節受體細胞功能。外泌體的功能及內容物隨其分泌細胞的變化而變化，而微環境的變化可影響細胞及外泌體的功能[13]。中藥復方通過發揮辨證論治和整體治療的優勢，能夠調整人體陰陽虛實，達到陰平陽秘的狀態；同時，現代研究顯示中藥單體或復方能夠通過改變局部微環境，延緩或改善疾病狀態[14]。既往研究表明：治療糖尿病腎病的保腎通絡方通過降低外泌體內miR-192的表達水平抑制腎纖維化的發生[15]；健脾消癌方降低由外泌體及TGF-β1誘導的正常人胚肺成纖維細胞（HFL1）活化，抑制結腸癌肺部轉移[16]；滋陰化痰方通過調控腫瘤細胞來源的外泌體抑制胃癌細胞的血管生成[17]。在本研究中，我們得出了類似的結果，補腎益精中藥復方可以通過影響HUVEC來源的外泌體功能，通過外泌體途徑促進正常血管內皮細胞的增殖、成管能力及硬皮病小鼠皮膚血管的再生修復，提高ANG-1、VEGF、vWF等重要促血管生成因子的表達水平。

外泌體介導的效應基于其內部所攜帶物質對受體細胞的調節作用。有研究[18]表明，攜帶miR-151-5P的骨髓間充質干細胞源性的外泌體，經受體骨髓間充質干細胞接收后，可下調受體細胞內mTOR信號通路，進而改善SSc小鼠骨量減少、皮膚緊繃及免疫紊亂的表現。此外，有研究[19]顯示，伴有血管損害的SSc患者血清中外泌體水平較正常者低，但局部皮損處成纖維細胞中的外泌體標志物（CD63、CD9及CD81）的表達水平卻較正常成纖維細胞顯著增高，提示血管功能的異常可影響外泌體的組織分布。本研究雖明確了外泌體可介導補腎益精中藥復方對SSc的血管保護作用，但其具體作用方式及分子機制尚不明確，有待深入研究。由于早期血管損傷是SSc疾病進展加重的重要因素，故本研究中，我們選擇小鼠造模第1、7天給予外泌體干預，以觀察外泌體對早期血管損傷的保護作用。盡管明確了外泌體可介導補腎益精中藥復方對SSc早期血管損傷的保護作用，但不同濃度及不同治療頻率外泌體的療效差異尚不明確，亦有待后續進一步研究。

綜上所述，本研究證實了補腎益精法的血管保護作用可由血管內皮細胞來源的外泌體介導，但該研究目前僅限于觀察性研究，具體的作用途徑及機制仍有待進一步深入探索。