逍遙散對卒中后抑郁大鼠的治療機制研究

付劭靜，周延華，卑紅喆，姜連堃，楊月明

[1.內蒙古醫科大學第三附屬醫院（內蒙古包鋼醫院）神經內科，內蒙古包頭 014000；2.內蒙古醫科大學第三附屬醫院（內蒙古包鋼醫院）藥劑科，內蒙古包頭 014000]

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）屬于卒中后的一種多發性、情感性精神障礙類疾病，典型的臨床表現包括情緒低落、嚴重失眠、頭暈頭痛、腸胃不適、記憶力下降、暴躁易怒等。有數據[1-2]顯示，PSD越來越常見，發生率不減反增。與非抑郁患者相比，PSD患者病情進展更快，研究[1，3]表明，PSD可增加患者的死亡風險及病死率。在PSD治療中有效緩解患者抑郁狀態對疾病控制和病情康復有重要的臨床意義。中醫藥具有相對安全、多效應、效果持久等優點，逐漸成為該領域的研究熱點。經典方劑逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，有疏肝解郁、養血健脾功效，為中醫學領域首選抗抑郁的中藥復方[4]。已有研究[5-7]表明逍遙散發揮抗抑郁作用，可被用于治療應激誘發的精神性疾病，諸如偏頭痛、抑郁焦慮、失眠癥以及帕金森病等。本研究通過構建PSD大鼠模型，進一步探討逍遙散的干預機制，旨在為其臨床應用治療PSD提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只SPF級U14品系雄性SD大鼠，30周齡，體質量320～350 g，購自內蒙古大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（蒙）20030001。飼養環境和條件：飼養于本實驗動物中心實驗室，每籠5只（7 d后，對于隨機選取的擬造模大鼠采取單籠飼養），飼養溫度控制在25℃，相對濕度控制在53%～55%，通風換氣10次/h，光照、黑暗按照12 h/12 h交替變化，期間大鼠自由獲取食物和水。

1.2 藥物逍遙散組成：北柴胡、白芍、當歸、白術、茯苓各30 g，薄荷、煨姜各10 g，炙甘草15 g。以上中藥材均購自內蒙古東誠中藥有限公司，由本院中藥研究中心專業姜連堃中藥師鑒定。常規方法煮沸、濃縮至實驗目的濃度。

1.3 試劑與儀器尼氏染色法試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；一氧化氮合酶（iNOS）、白細胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒由北京全式金生物技術有限公司提供；五羥色胺（5-HT）、五羥吲哚丁酸（5-HIAA）ELISA檢測試劑盒由天津市廣成化學試劑有限公司提供；兔抗鼠谷氨酸轉運體1（GLT-1）、腦源性神經營養因子（BDNF）、Caspase-9和Caspase-3及其剪切體、GAPDH等抗體由美國Abcam公司提供；羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的免疫球蛋白（IgG）由美國Abcam公司提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、蛋白免疫印跡（Western Blot）化學發光試劑盒由美國Thermo公司提供；Bradford蛋白定量試劑盒由北京全式金生物技術有限公司提供；TRIzol RNA提取試劑由美國Gibco公司提供。酶標儀由美國Thermo公司提供；光學顯微鏡由日本Nikon公司提供；凝膠成像分析儀由法國Vilber Lourm公司提供；紫外分光光度計由美國Beckman公司提供）；電泳儀和電泳槽，由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.4 PSD大鼠模型的建立造模方法參考賀旭等[8]方法，采用四血管阻斷法構建大鼠缺血性腦卒中模型。四血管阻斷法：1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于腦立體定位儀臺面，沿頸部正中線一側行手術切口，鈍性分離頸部兩側頸總動脈，電凝大鼠兩側椎動脈，第2天采用乙醚吸入麻醉，外科縫線拉出頸總動脈，微動脈夾阻塞血管30 min后再灌注。若大鼠出現瞳孔放大、呼吸加深、翻正反射消失，則判斷卒中模型制作成功[8]。卒中模型制作成功7 d后，采用社會隔離+慢性不可預見性溫和應激（CUMS）方法制備PSD大鼠模型。CUMS方法主要包括禁食水、束縛、噪音、夾尾、冰水、熱水、傾斜、異物等各種不同的應激刺激，每日1種刺激，連續6周，隨機交替進行。

1.5 給藥與分組將造模成功的大鼠隨機分為模型組及逍遙散低、中、高劑量組，每組各10只，另將剩余的10只大鼠設為正常組。造模的同時，逍遙散低、中、高劑量組分別對應給予4.5、9、18 g·kg-1·d-1（生藥）逍遙散煎劑灌胃，正常組、模型組灌胃等體積的生理鹽水，每日1次，連續給藥6周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 采用Zea-Longa法[9]評價大鼠神經功能損傷情況 采用Zea-Longa 5級評分法，分值范圍為0～4分，分值高低與神經功能缺損程度呈正相關，其中0分表示正常，1分表示左前肢不能完全伸展，2分表示向左轉圈，3分表示向左傾倒，4分表示意識喪失，不能行走。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腦組織病理形態學變化 頸椎脫臼法處死大鼠，于冰上解剖取出腦組織，40 g/L多聚甲醛固定，依次脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察各組腦組織病理形態學變化情況，拍照記錄。

1.6.3 尼氏染色法檢測腦組織神經細胞凋亡情況 按照上述“1.6.2”項中同樣方法制作石蠟切片，常規脫蠟至水，用50℃甲苯胺藍水溶液浸染15 min后，立即用水洗一遍，然后按照常規方法進行脫水，依次二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分別透明10 min，封片，最后于顯微鏡下觀察和拍照。

1.6.4 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血液中iNOS、TNF-α、IL-10和腦組織5-HT及其代謝物5-HIAA水平 具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，應用酶標儀檢測。

1.6.5 Western Blot法檢測腦組織GLT-1、BDNF，Caspase通路相關蛋白（Caspase-9、Caspase-3及其剪切體）等蛋白相對表達水平 取出凍存的腦組織，提取總蛋白，BCA定量試劑盒測定總蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白后進行轉膜、封閉；分別加入稀釋后的一抗GLT-1、BDNF、Caspase-9及其剪切體、Caspase-3及其剪切體以及GAPDH（除GAPDH以1∶100稀釋外，其余抗體均以1∶1 000稀釋），4℃冰箱孵育過夜；TBST洗3～5次，15 min/次，室溫孵育二抗1 h；TBST洗3～5次，15 min/次，利用Western Blot化學發光試劑盒顯色和拍照。最后采用凝膠成像分析儀掃描各Western Blot條帶灰度值并進行分析，結果以目的蛋白與內參（GAPDH）的灰度值比值表示。

1.6.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測腦組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）mRNA表達水平 SOD上游引物序列為5’-CTTCC TCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3’，下游引物序列為5’-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3’；MDA上游引物序列為5’-CAGGAAACAGCTATGA CC-3’，下游引物序列為5’-TGTAAAACGACGGC CAGT-3’。提取腦組織總RNA，進行反轉錄。以20μL反應體系進行檢測，反應體系：1×SYBR Green I master-mix、0.5μmol/L特異反向引物、0.5μmol/L特異前向引物、1μL反轉錄產物。反應條件：預變性95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，72℃30 s，共循環40次。應用ABI 7600儀器進行RT-PCR，樣品均設3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因，ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。

1.7 統計方法所有實驗均重復3次。采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較圖1結果顯示：與正常組比較，模型組神經功能缺損評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組神經功能缺損評分均顯著降低，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織病理形態學變化比較圖2結果顯示：正常組海馬組織細胞界限、細胞內結構（如核膜、核仁等）均清晰可見，海馬錐體細胞排列較為緊密，間質無水腫，細胞核圓又大、染色淡；模型組海馬組織細胞界限模糊，海馬錐體細胞排列混亂、模糊，部分細胞核發生皺縮，染色較深，間質有水腫現象；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組腦組織病理形態均得到不同程度的改善，其中逍遙散高劑量組最優、逍遙散中劑量組次之。

2.3 各組大鼠腦組織神經細胞凋亡情況比較圖3結果顯示：正常組可見較多的尼氏小體；模型組、逍遙散低劑量組幾乎沒有尼氏小體；逍遙散中劑量組、逍遙散高劑量組可見較多的尼氏小體，且逍遙散高劑量組較逍遙散中劑量組可見更多的尼氏小體。

2.4 各組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量比較圖4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量均顯著升高，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（±s）Figure 1 Comparison of neurological deficit scores between various groups of rats（±s）

2.5 各組大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量比較圖5結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠血清iNOS、TNF-α含量均顯著降低，IL-10含量均顯著升高，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織病理形態學變化比較（HE染色）Figure 2 Comparison of histomorphological changes in the brain tissue between various groups of rats（by HE staining）

圖3 各組大鼠腦組織神經細胞凋亡情況比較（尼氏染色）Figure 3 Comparison of apoptosis of neuralcells in brain tissue between various groups of rats（by Nisslstaining）

2.6 各組大鼠腦組織SOD、MDA mRNA表達比較圖6結果顯示：與正常組比較，模型組腦組織SOD mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），MDA mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組腦組織SOD mRNA表達水平均顯著升高，MDA mRNA表達水平均顯著降低，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量比較（±s）Figure 4 Comparison of 5-HT and 5-HIAA contents in brain tissue in various groups of rats（±s）

2.7 各組大鼠腦組織Caspase-9、Caspase-3及其剪切體表達情況比較圖7結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦組織Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Cleaved Caspase-3/Caspase-3水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠腦組織Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Cleaved Caspase-3/Caspase-3水平均顯著降低，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.8 各組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達比較圖8結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達水平均顯著升高，其中，逍遙散中、高劑量組的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量比較（±s）Figure 5 Comparison of serum iNOS，TNF-αand IL-10 levels in various groups of rats（±s）

圖6 各組大鼠腦組織SOD、MDA mRNA表達比較（±s）Figure 6 Comparison of SOD and MDA mRNA expression in brain tissue between various groups of rats（±s）

圖7 各組大鼠腦組織Caspase-9、Caspase-3及其剪切體表達情況比較（±s）Figure 7 Comparison of expression of Caspase-9，Caspase-3 and their shedders in various groups of rats（±s）

圖8 各組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達比較（±s）Figure 8 Comparison of GLT-1 and BDNF protein expression in brain tissue in various groups of rats（±s）

3 討論

對于卒中后抑郁（PSD）患者需重視抗抑郁治療[1-3]。PSD發病機制涉及神經、內分泌、免疫等多方面。研究發現，抑郁癥患者腦組織出現不同程度的病理學形態變化，推測海馬神經細胞損傷與抑郁癥發病有關，而凋亡是神經細胞損傷的主要形式之一[10-11]。另有研究[12]發現，氧化應激刺激可以降低機體本身神經元水平，同時會降低機體單胺類神經遞質含量，終致抑郁。5-HT為單胺類神經遞質分子，5-HIAA是5-HT代謝終產物之一，無生物學活性。5-HT參與調控人類多種行為學現象，與抑郁焦慮、暴躁等性格問題關聯密切[13]。又有相關文獻報道[14]指出，抑郁癥患者的免疫功能會發生一定程度的變化，主要表現為免疫系統過度活躍，諸如細胞因子釋放增多、急性炎癥反應等。研究發現，身體或心理應激將誘導體內細胞因子釋放量增多，給予大鼠心理應激30 min后可檢測到IL-10、TNF-α水平急劇上升的狀態，上升幅度與給予的刺激時間和刺激強度呈正相關。iNOS、IL-10、TNF-α等是細胞內典型的炎性反應因子，參與調控發熱、進食、睡眠、感染等過程，有文獻研究[15]表明其水平過高與情緒低落、抑郁以及精神分裂等情感障礙相關。GLT-1是機體內清除突觸間隙過高濃度谷氨酸的重要蛋白，可保護神經元免受神經毒性損害[16]。BDNF是機體細胞內重要的神經營養蛋白分子，可促進外周神經元存活和分化。研究[17]表明，BDNF在中樞神經元呈泛表達，有參與維持神經元形態學及行為學調控的功能，與人類精神性疾病相關。

本研究結果顯示：模型組大鼠腦組織海馬細胞排列紊亂無序，細胞界限以及細胞內結構模糊，細胞核發生皺縮，未見尼氏小體；模型組大鼠Zea-Longa評分，凋亡相關蛋白Caspase-9剪切蛋白、Caspase-3剪切蛋白，氧化應激產物MDA及炎癥因子iNOS水平均顯著高于正常組，GLT-1、BDNF、5-HT、5-HIAA、SOD水平均顯著低于正常組。表明PSD模型大鼠發生了神經細胞突質性病變，PSD并非完全是功能性主觀性疾病，與腦組織海馬神經細胞損傷以及氧化應激損傷同樣有一定的關聯。而逍遙散組腦組織損傷以及氧化應激相關指標均有不同程度改善，表明給予PSD模型大鼠逍遙散干預可修復神經細胞損傷，抑制神經細胞凋亡及氧化應激損傷。本研究還發現，模型組大鼠促炎因子iNOS、TNF-α，抑炎因子IL-10水平較正常組均顯著升高，逍遙散組可下調iNOS、TNF-α水平，上調IL-10水平，表明逍遙散可改善PSD大鼠的炎癥反應。

綜上所述，逍遙散可通過抑制PSD大鼠神經細胞凋亡，調節神經內分泌，改善免疫功能和氧化應激損傷發揮抗抑郁作用。但本研究存在一定局限性，由于時間限制和經費限制，未設陽性對照組，研究結果可能有一定偏倚，有待進一步完善。