針藥結(jié)合對腦梗死大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及血管生成的影響

趙輝，楊曉靜，程芳，沈菲，張靜，高宏波，袁玉欣

（河北省退役軍人總醫(yī)院康復醫(yī)學科，河北邢臺 054000）

腦梗死（cerebral infarction）是指因腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致局限性腦組織缺血性壞死或軟化，而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損，以猝然昏仆、口舌歪斜、半身不遂、語言不利為主癥的疾病[1]。腦梗死是嚴重危害中老年人健康的常見病，具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復發(fā)率高及并發(fā)癥多等“四高一多”的特點，且發(fā)病有明顯年輕化趨勢[2]。對腦梗死的防治具有重要意義，處理上應(yīng)強調(diào)早期診斷、早期治療、早期康復和早期預防再發(fā)[1]。臨床常將針藥結(jié)合的方法運用到腦梗死的治療中。本課題組采用電針聯(lián)合大黃、水牛角水煎液治療腦梗死，取得較好的療效，但其作用機制尚不明確。因此，本研究建立腦梗死大鼠模型，觀察電針聯(lián)合大黃、水牛角水煎液對腦梗死大鼠的治療機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SPF級健康成年雌雄參半的SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（粵）2019-0006。飼養(yǎng)溫度22℃，濕度保持在50%～65%，自由飲水及攝食。適應(yīng)周圍環(huán)境7 d后，按《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗，動物實驗于河北省退役軍人總醫(yī)院附屬動物實驗中心進行。

1.2 藥物生大黃、水牛角中藥材由武漢市武昌區(qū)藥材公司提供。生大黃、水牛角按10∶2比例組成，常規(guī)方法煎煮。

1.3 主要試劑與儀器蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自南京生航生物技術(shù)有限公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的d UTP缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒，腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自南京諾唯贊有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒購自凱基有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由上海復生生物工程研究所合成；血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）抗體購自美國Santa Cruz公司。G6805-2電針治療儀購自上海涵飛醫(yī)療器械有限公司；蛋白電泳儀購自南大普陽科學儀器研究所；CG-05熒光定量PCR儀器購自力新儀器（上海）有限公司；SDS-800凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司；電泳槽購自美國Pharmacia公司；高速冷凍離心機購自北京金恒祥有限公司。

1.4 分組與造模將40只大鼠隨機分為5組，即假手術(shù)組、模型組、電針組、中藥組、針藥組，每組8只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠參考文獻方法[3-4]建立腦梗死模型。操作方法如下：采用1%戊巴比妥鈉麻醉后，在大鼠頭部正中偏右側(cè)做一切口，分離頸部總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，在頸外動脈遠心端進行結(jié)扎，采用動脈夾阻斷動脈血流，插入栓線，放開夾子，推動栓線至阻力，栓線插至16～18 mm，2 h后拔出栓線。假手術(shù)組分離頸動脈不結(jié)扎，縫合切口。造模后給予抗感染護理，自由飲水攝食。造模成功標準按照Zea-Longa[5]原則判定，1～3分為造模成功。

1.5 干預方法大鼠用藥量按人與大鼠體表面積比值換算法求得。從建模后第1天開始，中藥組大鼠給予大黃、水牛角水煎液5 g/kg灌胃，每日1次，7 d為1療程，共2個療程；電針組采用電針治療，用華佗牌28號1.5寸（3.3 cm）毫針針刺百會、足三里及水溝穴，將針柄用導線分別連接到定量針麻儀的電極上，增加頻率為5～15 Hz的疎密波，強度從1 V開始，最大強度為3 V，針刺5 min后增加1個強度，留針15 min，每日1次，每日電針時間相同，7 d為1個療程，共2個療程。針藥組為中藥組、電針組上述干預方法聯(lián)合使用；假手術(shù)組與模型組大鼠均灌胃等體積的生理鹽水，每日1次，7 d為1個療程，共2個療程。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 干預第1、7、14天時，分別采用Zea-Longa 5分法[5]評價大鼠神經(jīng)功能。無神經(jīng)功能損傷，計0分；對側(cè)前肢不能完全伸展，計1分；行走時表現(xiàn)對側(cè)肢體旋轉(zhuǎn)，計2分；走時傾倒，計3分；意識喪失，計4分。

1.6.2 檢測氧化應(yīng)激、炎癥指標的血清水平 末次治療結(jié)束后，麻醉大鼠，采集眼眶靜脈血1.5 mL，離心收集上清液，采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA水平，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平，采用比色法檢測GSH-Px水平，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.6.3 TUNEL法檢測大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況 頸部脫臼處死大鼠，取腦組織，制備切片。具體操作方法按試劑盒說明書進行。光學顯微鏡下觀察凋亡神經(jīng)細胞。凋亡神經(jīng)細胞核呈棕黃色。隨機選擇5個視野下的細胞，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6.4 蛋白免疫印跡法檢測大鼠腦組織VEGF、bFGF蛋白表達水平 取腦組織，提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；加入5×SDS上樣緩沖液，使蛋白變性；加樣，進行SDS-PAGE凝膠垂直電泳，再將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；加入50 g/L脫脂奶粉，室溫封閉1 h；分別加入一抗稀釋液VEGF（1∶500）、bFGF（1∶500）、內(nèi)參β-actin（1∶2 000），室溫孵1 h后，4℃孵育過夜；洗膜，加入羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育1 h；洗膜，用電化學發(fā)光試劑（ECL）顯影。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集和分析，結(jié)果以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.6.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測大鼠腦組織VEGF、bFGF mRNA表達水平 取腦組織30 g，提取總RNA，應(yīng)用核酸定量儀檢測提取RNA的濃度和純度。按照第一鏈合成系統(tǒng)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以β-actin為內(nèi)參進行熒光定量PCR擴增。50℃預處理2 min，循環(huán)1次；95℃預變性10 min，循環(huán)1次；95℃變性15 s，50℃退火30 s，70℃延伸30 s，循環(huán)30次。各組均設(shè)3個復孔。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，PCR產(chǎn)物量以光密度×面積表示，根據(jù)2-△△Ct值計算目的基因的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 23.00統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較干預第1、7、14天：與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能缺損評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組、中藥組、針藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低（均P＜0.05），其中，中藥組與電針組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而針藥組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于電針組和中藥組（P＜0.05）。干預第14天，各治療組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于干預第1天。具體結(jié)果見表2。

2.2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標及炎癥指標血清水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MDA、TNF-α及IL-1β水平升高，SOD、GSH-Px水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，電針組、中藥組、針藥組大鼠血清中MDA、TNF-α及IL-1β水平降低，SOD、GSH-Px水平升高（均P＜0.05），其中，針藥組降低MDA、TNF-α、IL-1β作用及升高SOD、GSH-Px的作用，明顯優(yōu)于電針組、中藥組（均P＜0.05）。具體結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Table 2 Comparison of neurologicaldeficit scores between various groups of rats（±s，分）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Table 2 Comparison of neurologicaldeficit scores between various groups of rats（±s，分）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較；④P＜0.05，與中藥組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組中藥組針藥組鼠數(shù)/只8 8 8 8 8干預第1天0.00±0.00 3.12±0.60①2.70±0.46①②2.58±0.50①②1.95±0.30①②③④干預第7天0.00±0.00 3.36±0.66①2.51±0.47①②2.47±0.48①②1.73±0.22①②③④干預第14天0.00±0.00 3.14±0.58①2.10±0.36①②2.17±0.33①②1.42±0.18①②③④

2.3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況比較假手術(shù)組、模型組、電針組、中藥組、針藥組腦組織神經(jīng)細胞凋亡率分別為（2.15±0.20）%、（41.10±3.65）%、（19.30±2.17）%、（20.25±2.03）%、（12.05±1.33）%，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。進一步比較：與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，電針組、中藥組、針藥組神經(jīng)細胞凋亡率降低（P＜0.001），其中，電針組與中藥組神經(jīng)細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.421），而針藥組神經(jīng)細胞凋亡率低于電針組與中藥組（P＜0.001）。各組神經(jīng)細胞凋亡情況如圖1所示。

2.4 各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF蛋白表達比較模型組大鼠腦組織中VEGF、bFGF蛋白表達水平低于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組、中藥組與針藥組VEGF、bFGF蛋白表達水平高于模型組（P＜0.05），而針藥組大鼠腦組織中VEGF、bFGF蛋白表達水平明顯高于電針組與中藥組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表4、圖2。

2.5 各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF mRNA表達比較模型組大鼠腦組織中VEGF、bFGF mRNA相對表達水平低于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組、中藥組與針藥組大鼠腦組織VEGF、bFGF mRNA相對表達水平高于模型組（P＜0.05），而針藥組大鼠腦組織VEGF、bFGF mRNA相對表達水平明顯高于電針組與中藥組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表5。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標及炎癥指標血清水平比較Table 3 Comparison of serum levels of oxidative stress indexes and inflammatory markers between various groups of rats（±s）

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標及炎癥指標血清水平比較Table 3 Comparison of serum levels of oxidative stress indexes and inflammatory markers between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較；④P＜0.05，與中藥組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組中藥組針藥組鼠數(shù)/只8 8 8 8 8 MDA/（nmol·mL-1）11.56±3.25 26.03±4.57①16.33±4.18①②16.17±4.38①②12.08±3.22①②③④SOD/（U·mL-1）308.50±29.66 231.05±30.54①278.53±41.22①②280.05±40.56①②295.36±36.5 3①②③④GSH-Px/（μmol·mL-1）105.20±15.47 71.22±11.45①85.36±12.41①②86.12±12.31①②96.24±15.05①②③④TNF-α/（ng·mL-1）1.45±0.20 2.61±0.30①1.78±0.19①②1.80±0.20①②1.60±0.17①②③④IL-1β/（ng·mL-1）0.11±0.02 0.30±0.04①0.21±0.03①②0.20±0.02①②0.14±0.03①②③④

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況比較（TUNEL法，×200）Figure 1 Comparison of apoptosis of neuralcells in brain tissues between various groups of rats（by TUNEL method，×200）

表4 各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expression of VEGF and bFGF in brain tissues between various groups of rats（±s）

表4 各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expression of VEGF and bFGF in brain tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較；④P＜0.05，與中藥組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組中藥組針藥組鼠數(shù)/只8 8 8 8 8 VEGF蛋白相對表達量1.07±0.11 0.36±0.05①0.69±0.06①②0.71±0.05①②0.92±0.04①②③④bFGF蛋白相對表達量0.96±0.03 0.40±0.04①0.65±0.07①②0.69±0.05①②0.84±0.03①②③④

3 討論

圖2 各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF蛋白電泳條帶圖Figure 2 Electrophoretic stripes of VEGF and bFGF proteins in brain tissues in various groups of rats

表5各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF mRNA表達比較Table 5 Comparison of mRNA expression of VEGF and bFGF in brain tissues in various groups of rats（±s）

表5各組大鼠腦組織中VEGF、bFGF mRNA表達比較Table 5 Comparison of mRNA expression of VEGF and bFGF in brain tissues in various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與電針組比較；④P＜0.05，與中藥組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組中藥組針藥組鼠數(shù)/只8 8 8 8 8 VEGF mRNA相對表達量1.00±0.00 0.22±0.03①0.58±0.04①②0.55±0.06①②0.83±0.05①②③④bFGF mRNA相對表達量1.00±0.00 0.30±0.02①0.62±0.03①②0.59±0.05①②0.90±0.04①②③④

腦梗死可歸屬于中醫(yī)學“中風病”的范疇，中醫(yī)病機為“竅閉神匿，神不導氣”[6]，治療應(yīng)遵循“病變在腦，首取督脈”原則，故本研究針刺選擇百會穴、水溝穴。百會穴，屬督脈，可開竅醒腦、回陽固脫。水溝穴，屬督脈，清熱開竅、回陽救逆。針刺百會穴、水溝穴，可改善腦梗死患者認知和運動功能障礙[7-10]。中風的發(fā)生與氣血虧虛、臟腑功能失調(diào)有關(guān)。故本研究針刺選擇足三里穴。足三里穴，屬足陽明胃經(jīng)，可燥化脾濕，生發(fā)胃氣。針刺足三里可以改善局部氣血，促進肢體功能恢復[11]。中風病之病位在腦絡(luò)，以通里攻下、化痰通腑為代表的“上病下治”法具有治療中風病的普適性[12-13]。故本研究選擇通腑瀉熱、涼血解毒中藥大黃、水牛角進行治療。大黃，性寒味苦，歸大腸及肝經(jīng)，具有清熱、通絡(luò)、解毒、化瘀之功效。水牛角，性寒味咸，入肝、心經(jīng)，有涼血定驚、清熱解毒之功。臨床上應(yīng)用大黃、水牛角治療腦梗死急性期屬于痰熱腑實證患者取得良好效果[14-16]。本研究應(yīng)用電針聯(lián)合大黃、水牛角煎液治療腦梗死大鼠，結(jié)果顯示，其可明顯保護腦梗死大鼠神經(jīng)功能。

既往研究證實，腦梗死往往伴隨著缺血再灌注損傷，腦組織恢復血液后腦組織損傷沒有緩解反而會加重，并引起一系列炎癥反應(yīng)產(chǎn)生自由基導致腦細胞繼發(fā)性損傷，加大梗死體積。腦梗死后再灌注損傷能夠引起腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)促進大量炎癥介質(zhì)釋放，加重神經(jīng)細胞凋亡及神經(jīng)功能損傷。有研究[17]表明，急性腦梗死患者血清TNF-α和IL-1β含量顯著高于對照組，增高的程度與神經(jīng)功能缺損程度及梗死灶大小密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MDA、TNF-α及IL-1β水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，神經(jīng)細胞凋亡率升高（均P＜0.05）；與模型組比較，電針組、中藥組、針藥組大鼠血清MDA、TNF-α及IL-1β水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，神經(jīng)細胞凋亡率降低（均P＜0.05），而針藥組的作用效果明顯優(yōu)于電針組、中藥組。表明電針聯(lián)合大黃、水牛角煎液對腦梗死大鼠具有保護神經(jīng)功能的作用，能夠降低氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，改善腦組織損傷。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)類似于中醫(yī)學“毒”的特性，本研究結(jié)果體現(xiàn)了電針聯(lián)合大黃、水牛角煎液“解毒”的基本治法。

血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）屬于血小板衍生生長因子（PDGF）家族成員之一，屬于分泌性多肽物質(zhì)，在正常機體內(nèi)能夠促進胚胎發(fā)育及血管再生。當發(fā)生腦梗死時，VEGF及受體表達降低，可引起腦組織梗死面積加大、神經(jīng)細胞死亡加重。有研究報道，VEGF能夠加快腦局部血液循環(huán)，發(fā)揮促進神經(jīng)組織再生及神經(jīng)增殖的作用[18-19]。本研究針刺堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）為神經(jīng)營養(yǎng)因子，也是一種多效能生長因子，可對抗細胞內(nèi)鈣超載、抑制細胞凋亡、清除自由基、拮抗興奮性氨基酸毒性及抗氧化等多種生物學活性，促進細胞增殖分化、組織增生和血管形成，并參與炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合[20]。臨床研究[21]表明，腦梗死患者血清bFGF水平明顯增高，且與梗死灶大小關(guān)系密切，恢復期時血清bFGF水平較急性期明顯下降。還有研究[22]表明，急性腦梗死患者血清VEGF和bFGF濃度的變化與病程、梗死面積大小及腦神經(jīng)功能恢復情況均具有一定的相關(guān)性。提示VEGF和bFGF濃度與腦梗死后新血管形成關(guān)系密切，二者可作為判斷梗死面積與預后的新外周指標。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠腦組織中VEGF、bFGF mRNA與蛋白表達水平低于假手術(shù)組（P＜0.05），中藥組、電針組與針藥組VEGF、bFGF的mRNA與蛋白表達水平高于模型組（均P＜0.05），而針藥組大鼠腦組織中VEGF、bFGF的mRNA與蛋白表達水平高于中藥組與電針組（P＜0.05）。表明電針聯(lián)合大黃、水牛角煎液可改善腦梗死大鼠新血管形成，含“活血化瘀”之效，且療效優(yōu)于單用黃角湯或單用電針。

綜上所述，電針聯(lián)合大黃、水牛角煎液能夠顯著改善大鼠腦梗死病變，其可通過降低氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)發(fā)揮保護神經(jīng)功能的作用。本研究存在一定的局限性，今后可加強與其他單位合作，深入開展相關(guān)機制研究，為腦梗死臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。