4種LED光源對(duì)1齡赤點(diǎn)石斑魚生長(zhǎng)和發(fā)育的影響

徐文剛，劉立明，王九龍，于文松，張建柏，征矢野清，唐永政

( 1.煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005； 2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264003； 3.長(zhǎng)崎大學(xué) 環(huán)中國(guó)東海環(huán)境資源研究所，日本 長(zhǎng)崎 851-2213 )

魚類成長(zhǎng)周期中，內(nèi)分泌系統(tǒng)中的腦—垂體—性腺軸(BPG軸)分泌的激素能夠調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、新陳代謝和能量平衡[12]。研究表明，光質(zhì)能改變魚類晝夜節(jié)律，調(diào)節(jié)BPG軸中與生長(zhǎng)相關(guān)激素的分泌而影響生長(zhǎng)[12-13]。生長(zhǎng)激素(GH)在腦垂體中合成，主要調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和新陳代謝，生長(zhǎng)抑素前體-Ⅰ(PSS-Ⅰ)在腦中合成并能抑制生長(zhǎng)激素的合成和分泌，神經(jīng)肽Y(NPY)則能刺激食欲并影響晝夜節(jié)律[12]。光質(zhì)通過調(diào)節(jié)魚類GH、PSS-Ⅰ和NPY基因的合成而影響其生長(zhǎng)[14]。Shin等[15]報(bào)道，綠光和藍(lán)光比紅光更能有效促進(jìn)克氏雙鋸魚(Amphiprionclarkii)中GH基因的合成而加速其生長(zhǎng)。

光質(zhì)不僅能影響魚類的生長(zhǎng)，也能通過調(diào)節(jié)BPG軸中與繁殖相關(guān)激素的合成而影響其繁殖。已有研究表明，光質(zhì)能調(diào)節(jié)河鱸(Percafluviatilis)[16]和星點(diǎn)東方鲀(Takifuguniphobles)[17]腦垂體中促性腺激素(GtHs)的分泌而影響其性成熟。GtHs基因中的β亞基單元有兩種類型：促卵泡激素(FSHβ)和黃體生成素(LHβ)，F(xiàn)SHβ和LHβ基因受到下丘腦中促性腺激素釋放激素(GnRH)的調(diào)節(jié)[12]。近年研究表明，腦中分泌的Kisspeptin激素處于上游調(diào)控階段，能夠調(diào)節(jié)GnRH和GtHs基因的合成和分泌。Kisspeptin基因中的Kiss1和Kiss2基因與其受體G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)結(jié)合后直接刺激GnRH神經(jīng)元，從而促進(jìn)GtHs基因的合成，其功能與魚類的BPG軸相對(duì)應(yīng)[18-19]。Shin等[20-22]報(bào)道，光質(zhì)不僅能影響金魚(Carassiusauratus)繁殖系統(tǒng)中各激素的合成和分泌，也能影響紅鰭東方鲀(T.rubripes)的生長(zhǎng)和星點(diǎn)東方鲀[17]的成熟。因此，筆者以日本海域較具代表性的赤點(diǎn)石斑魚為研究對(duì)象，探究不同光質(zhì)LED光源對(duì)其1齡個(gè)體生長(zhǎng)和性腺發(fā)育的影響；同時(shí)也探究不同光質(zhì)對(duì)試驗(yàn)魚腦和腦垂體中與生長(zhǎng)相關(guān)的基因如GH、PSS-Ⅰ和NPY，以及與繁殖相關(guān)的基因如Kiss1、Kiss2、GPR54、sbGnRH、FSHβ和LHβ表達(dá)量的影響，以期為未來石斑魚工業(yè)化高效養(yǎng)殖、資源保護(hù)及人工繁殖方面提供基礎(chǔ)生物學(xué)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

取168尾1齡左右赤點(diǎn)石斑魚[體質(zhì)量(42.29±0.77) g，體長(zhǎng)(15.6±0.07) cm]，其中8尾作為試驗(yàn)開始前的對(duì)照樣本，余下160尾飼養(yǎng)在4個(gè)裝有開放式流水系統(tǒng)和曝氣裝置的500 L水槽中，每個(gè)水槽放置40尾試驗(yàn)魚，待其適應(yīng)水溫和攝食等條件后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)間為2018年7月24日至9月23日。各組試驗(yàn)魚暴露在白光色溫3000 K、紅光590 nm、藍(lán)光480 nm、綠光520 nm 4種不同光質(zhì)LED光源下飼養(yǎng)2個(gè)月，并在四周覆蓋黑色塑料布以避免自然光干擾。每個(gè)水槽放置8個(gè)0.72 W的LED燈，固定在距水面22～25 cm處，光照度約580 lx，光照周期為12L∶12D。試驗(yàn)期間水溫為22.3～28.8 ℃(圖1)，鹽度29～31，pH 7.9～8.3，溶解氧>5 mg/L，24 h增氧。試驗(yàn)期間每日早晚各投喂1次，觀察試驗(yàn)魚的攝食情況并記錄每日攝食量和水溫的變化，所用飼料為Ohitome EP2 (日清丸紅飼料，日本)。試驗(yàn)期間無個(gè)體死亡。

圖1 7月24日至9月23日試驗(yàn)期間海水水溫的變化

1.2 采樣方法

1.2.1 體長(zhǎng)和體質(zhì)量的測(cè)定

試驗(yàn)開始時(shí)、試驗(yàn)1個(gè)月和2個(gè)月后，分別測(cè)量各水槽中每尾魚的體長(zhǎng)和體質(zhì)量，并按下式計(jì)算肥滿度(CF)、體質(zhì)量增加率(wWGR，%)和特定生長(zhǎng)率(RSG，%/d)：

CF=100m/L3

(1)

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

(2)

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

(3)

式中，L為體長(zhǎng)，m為體質(zhì)量，mt為終末平均體質(zhì)量，m0為初始平均體質(zhì)量，t為飼育時(shí)間。

1.2.2 樣品的采集

試驗(yàn)開始前對(duì)對(duì)照樣本中的8尾魚進(jìn)行采樣，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各光質(zhì)組再分別取8尾魚作為試驗(yàn)樣本。使用2-苯氧乙醇將魚麻醉后，測(cè)量其體長(zhǎng)和體質(zhì)量，然后取出性腺，稱量質(zhì)量后將其立即置于波恩試劑中，固定24 h后于70%乙醇中保存，用于組織學(xué)分析。隨后打開頭蓋骨，取腦和腦垂體。由于所采集的腦部樣品較大，將腦短暫保存于液氮后移至-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存，腦垂體置于RNAlater試劑(Ambion Inc.，Invitrogen Life Technologies，Japan)中4 ℃低溫保存，1周后廢棄RNAlater試劑，移至-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存，用于分子生物學(xué)試驗(yàn)。

1.2.3 性腺的組織學(xué)觀察

組織學(xué)分析步驟參照文獻(xiàn)[23]的方法，對(duì)赤點(diǎn)石斑魚性腺進(jìn)行常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和連續(xù)切片，厚度為5 μm。采用蘇木精—伊紅染色，中性樹膠封片，Olympus FX380型光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，以個(gè)體中卵母細(xì)胞最發(fā)達(dá)階段為性腺發(fā)育階段。參照文獻(xiàn)[24-25]的方法對(duì)性腺發(fā)育進(jìn)行分期。

1.2.4 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取凍存的赤點(diǎn)石斑魚腦和腦垂體，參照TRIzol試劑盒(Life Technologies Corp.，USA)說明書進(jìn)行總RNA提取，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA完整度，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific Inc.，美國(guó))檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)Transcriptor first strand cDNA synthesis(Roche Diagnostic GmbH，Mannheim，德國(guó))說明書操作，取1 μg腦及腦垂體總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板合成第一鏈cDNA，用于PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.2.5 腦和腦垂體中各基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)

腦中PSS-Ⅰ、NPY、Kiss1、Kiss2、GPR54和sbGnRH基因以及腦垂體中GH、FSHβ和LHβ基因表達(dá)量的測(cè)定方法為根據(jù)基因庫(kù)中各基因序列用Primer 3 Plus軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，由Fasmac公司(Kanagawa，日本)合成，引物序列見表1。各基因的測(cè)定參照EvaGreen 2×qPCR MasterMix-Rox(Abm Inc.，加拿大)試劑盒上的說明書操作。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，5 μL EvaGreen 2×qPCR MasterMix，上下游引物(10 pmol/μL)各0.3 μL，2.4 μL滅菌超純水，總計(jì)10 μL。在CFX96 TouchTMReal-Time系統(tǒng)上(BioRad，美國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min熔解；最后50 ℃冷卻30 s。PCR反應(yīng)后獲得熔解曲線，檢測(cè)數(shù)據(jù)用相對(duì)定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，β-actin作為內(nèi)參基因。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。并用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，利用單因素方差分析，檢驗(yàn)體長(zhǎng)、體質(zhì)量、肥滿度以及各基因表達(dá)量的差異，運(yùn)用Tukey′s HSD多重比較檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)條件下赤點(diǎn)石斑魚生長(zhǎng)指數(shù)的差異

試驗(yàn)期間不同光質(zhì)條件下赤點(diǎn)石斑魚各生長(zhǎng)指數(shù)的變化見表2。由表2可見，試驗(yàn)1個(gè)月后白光組魚的體長(zhǎng)顯著高于藍(lán)光和綠光組(P<0.05)，體質(zhì)量和肥滿度顯著高于其他光質(zhì)組(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，白光組魚的體長(zhǎng)顯著高于藍(lán)光和綠光組(P<0.05)，體質(zhì)量顯著高于綠光組(P<0.05)，但肥滿度差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)白光組魚的體質(zhì)量增加率高于其他光質(zhì)組。

表2 試驗(yàn)期間不同光質(zhì)條件下赤點(diǎn)石斑魚各生長(zhǎng)指數(shù)的變化

2.2 不同光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚性腺發(fā)育的變化

試驗(yàn)開始時(shí)，試驗(yàn)魚性腺發(fā)育處于染色質(zhì)核仁期卵母細(xì)胞階段(圖2a)。卵巢內(nèi)可見染色質(zhì)核仁期卵母細(xì)胞，其直徑略大于卵原細(xì)胞。卵母細(xì)胞核較大，占據(jù)卵母細(xì)胞大部分面積。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚性腺發(fā)育均處于周邊核仁期卵母細(xì)胞階段(圖2b1～b4)。卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)體積增加且呈強(qiáng)烈嗜堿性；卵黃核出現(xiàn)且直徑增加，核內(nèi)有少量核仁分布。

圖2 試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)各光質(zhì)條件下赤點(diǎn)石斑魚的性腺發(fā)育

2.3 不同光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚腦和腦垂體中與生長(zhǎng)和繁殖相關(guān)各基因表達(dá)量的變化

試驗(yàn)魚腦和腦垂體中PSS-Ⅰ、NPY和GH與生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量的變化見圖3。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)白光組試驗(yàn)魚腦中PSS-Ⅰ基因表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)的表達(dá)量(P<0.05)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各光質(zhì)組NPY基因表達(dá)量均顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)的表達(dá)量(P<0.05)；GH基因表達(dá)量在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

圖3 試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)不同光質(zhì)條件下赤點(diǎn)石斑魚腦和腦垂體中PSS-Ⅰ(a)、NPY(b)和GH(c)基因表達(dá)量的差異

試驗(yàn)魚腦和腦垂體中Kiss1、Kiss2、GPR54、sbGnRH、FSHβ和LHβ與繁殖相關(guān)基因表達(dá)量的變化見圖4。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚腦中GPR54基因表達(dá)量均顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)的表達(dá)量(P<0.05)，白光和藍(lán)光組sbGnRH基因表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)的表達(dá)量(P<0.05)，但各光質(zhì)條件下腦中Kiss1基因表達(dá)量在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)開始時(shí)，試驗(yàn)魚腦中Kiss2基因表達(dá)量太低未檢測(cè)到，但試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各光質(zhì)條件下的表達(dá)量均有所增加。試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，各光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚腦垂體中FSHβ和LHβ基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

圖4 試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)不同光質(zhì)條件下赤點(diǎn)石斑魚腦和腦垂體中Kiss1(a)、Kiss2(b)、GPR54(c)、sbGnRH(d)、FSHβ(e)和LHβ(f)基因表達(dá)量的差異

3 討 論

3.1 光質(zhì)對(duì)試驗(yàn)魚生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)中，赤點(diǎn)石斑魚暴露在不同光質(zhì)下2個(gè)月后，其體長(zhǎng)、體質(zhì)量和體質(zhì)量增加率順序?yàn)榘坠饨M>紅光組>藍(lán)光組>綠光組，其中白光組最高，綠光組最低。已有研究表明，水溫13.6～16.7 ℃時(shí)，赤點(diǎn)石斑魚暴露在藍(lán)光下10周后比其他光質(zhì)更能促進(jìn)其體質(zhì)量的增加[26]。此外，褐石斑魚(E.bruneus)[27]暴露在綠光下生長(zhǎng)率最高，而點(diǎn)帶石斑魚(E.coioides)[28]暴露在紅光下死亡率最低。這些研究結(jié)果表明，當(dāng)石斑魚暴露在不同光質(zhì)下，由于水溫、環(huán)境和物種等因素的差異，光質(zhì)對(duì)其生長(zhǎng)的影響也有所不同。除石斑魚外，光質(zhì)也能影響其他魚類的生長(zhǎng)。研究表明，綠光有利于豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)[13]的攝食、生長(zhǎng)和存活，而黃光對(duì)紅鰭東方鲀仔稚魚[29]的生長(zhǎng)和發(fā)育具有促進(jìn)作用，紅光和綠光不適合其生存。Luchiari等[30]報(bào)道，紅光可能對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的生長(zhǎng)有害；而Volpato等[31]的研究表明，紅光能刺激其進(jìn)食，也有報(bào)道表明，藍(lán)光更能促進(jìn)其體長(zhǎng)和體質(zhì)量的增加[32]。以上的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同LED光質(zhì)能夠影響魚類的生長(zhǎng)，同時(shí)，魚類的生長(zhǎng)還受魚種、年齡、生理階段、飼養(yǎng)條件和溫度等條件差異的影響。

本試驗(yàn)中，白光組幼魚肥滿度在第1個(gè)月顯著高于其他光質(zhì)組，但2個(gè)月后差異卻不顯著。試驗(yàn)中第1個(gè)月的平均水溫為26.7 ℃，此水溫為赤點(diǎn)石斑魚的最適生長(zhǎng)條件，而第2個(gè)月的平均水溫僅為23.4 ℃。已有研究表明，恒溫26 ℃條件有助于加速赤點(diǎn)石斑魚的生長(zhǎng)[10]。對(duì)斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)[33]和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[34]的研究表明，在試驗(yàn)條件下，高水溫能促進(jìn)其生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中可能由于較高的水溫和白光的綜合作用使白光組幼魚在第1個(gè)月獲得較高的肥滿度。

3.2 光質(zhì)對(duì)試驗(yàn)魚腦和垂體中與生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚腦中的NPY基因表達(dá)量均顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)，表明4種光質(zhì)均能有效促進(jìn)赤點(diǎn)石斑魚的食物吸收、新陳代謝和能量平衡。本試驗(yàn)中，雖然試驗(yàn)魚暴露在白光下2個(gè)月后其體長(zhǎng)和體質(zhì)量均顯著高于其他光質(zhì)條件下，但白光組的GH基因表達(dá)量與其他光質(zhì)條件下和試驗(yàn)開始時(shí)均無顯著差異，而PSS-Ⅰ基因表達(dá)量卻顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)。研究表明，GH基因主要用于調(diào)節(jié)魚類的生長(zhǎng)，而PSS-Ⅰ基因能夠抑制GH基因的分泌[35]。本試驗(yàn)中，雖然白光組試驗(yàn)魚腦中PSS-Ⅰ基因表達(dá)量顯著增加，但其可能對(duì)GH基因的分泌沒有很強(qiáng)的抑制作用，因此對(duì)試驗(yàn)魚生長(zhǎng)的抑制作用有限。已有研究表明，魚類的生長(zhǎng)受到內(nèi)分泌因素如皮質(zhì)醇、甲狀腺激素以及與繁殖相關(guān)激素的綜合影響，導(dǎo)致生長(zhǎng)激素復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制[36]。因此，進(jìn)一步的研究需明確GH和PSS-Ⅰ基因具體的調(diào)節(jié)機(jī)制。

3.3 光質(zhì)對(duì)試驗(yàn)魚性腺發(fā)育以及腦和垂體中與繁殖相關(guān)基因表達(dá)量的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各光質(zhì)條件下試驗(yàn)魚性腺?gòu)娜旧|(zhì)核仁期卵母細(xì)胞發(fā)育至周邊核仁期卵母細(xì)胞，且各組試驗(yàn)魚的GPR54基因表達(dá)量以及白光和藍(lán)光組sbGnRH基因表達(dá)量均顯著高于試驗(yàn)開始時(shí)，而FSHβ和LHβ基因在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的表達(dá)量無顯著差異。研究表明，內(nèi)分泌系統(tǒng)中的Kiss、GnRH和GtHs基因在赤點(diǎn)石斑魚[10]、星點(diǎn)東方鲀[37]、歐洲舌齒鱸(Dicentrachuslabrax)[38-39]和海鱸(Moronesaxatilis)[40]成熟和繁殖過程中起重要作用。此外，在鮭魚[41]、星康吉鰻(Congermyriaster)[42]、鰻鱺(Anguillajaponica)[43]和歐洲舌齒鱸[44]中，F(xiàn)SHβ基因?qū)π韵僭缙诎l(fā)育如精子和卵子的生長(zhǎng)具有重要影響，而LHβ基因主要調(diào)控性腺發(fā)育的成熟階段如排卵和排精等行為，表明FSHβ和LHβ基因與多數(shù)魚類的性腺發(fā)育密切相關(guān)，且主要作用于青春期和成熟期。Tanaka等[45]報(bào)道，在人工養(yǎng)殖條件下，赤點(diǎn)石斑魚在2齡進(jìn)入青春期，3齡達(dá)到性成熟。而本試驗(yàn)中的赤點(diǎn)石斑魚僅為1齡，性腺尚處于初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育階段，兩者均遠(yuǎn)離成熟期。因此，與BPG軸功能相對(duì)應(yīng)的Kiss、GnRH和GtHs基因的角色和功能在此階段可能并不明顯，即使GPR54和sbGnRH基因表達(dá)量顯著增加，可能也無法有效地誘導(dǎo)FSHβ和LHβ基因的合成與分泌，導(dǎo)致FSHβ和LHβ基因表達(dá)量無顯著差異。類似結(jié)果也出現(xiàn)在對(duì)河鱸的研究中，當(dāng)未成熟的雄性和雌性河鱸暴露在白光、紅光、綠光或藍(lán)光下10 d后，F(xiàn)SHβ和LHβ基因表達(dá)量無顯著差異，原因可能是魚的繁殖周期尚未開始[16]。然而，當(dāng)金魚暴露在白光、紅光和綠光下4個(gè)月后，綠光下金魚腦和垂體中Kiss1、GPR54、GnRH、FSHβ和LHβ基因表達(dá)量卻顯著增加，其性腺也處于成熟卵母細(xì)胞發(fā)育階段，表明Kiss1、GPR54、GnRH、FSHβ和LHβ基因在其繁殖系統(tǒng)中起重要作用[20]。因此，進(jìn)一步的研究需明確不同光質(zhì)LED光源對(duì)成熟期赤點(diǎn)石斑魚繁殖系統(tǒng)發(fā)育的影響。