草魚腸道乳酸菌的分離鑒定及適用性能評價

肖 俊，張桂芳，李艷芳，丁立云，徐先棟，傅義龍，饒 毅

（江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039）

腸道微生物在魚類生長過程中起著非常重要的作用，其平衡狀態關系到魚類機體的健康。正常的腸道微生物菌群對魚體有營養、免疫調節和抑制病原菌等作用。有研究表明，魚飼料中添加益生菌可以提高魚類生產性能和飼料利用率，增強免疫能力。

發酵中草藥是將中草藥以一種或多種優選的益生菌作為菌種，在體外模擬腸道環境和中藥成分在體內的消化分解過程，對提取的中藥有效成分進行生物學轉化[1]。已有的研究證明發酵中草藥在促生長、增強水產動物非特異性免疫能力等方面優于未發酵的中草藥[2-3]。中草藥經益生菌發酵后，產生了更多的抑菌活性物質，中草藥中的營養物質有利于菌體的生長，因此益生菌和中草藥的協同作用使抑菌活性得到了增強[4]。目前的研究大部分都是集中在外源益生菌發酵中草藥上，從宿主體內分離益生菌發酵中草藥的研究還很少。研究表明從宿主體內篩選的益生菌能更好的適應宿主體內的環境并在宿主體內定殖[5]，因此篩選原籍益生菌至關重要。試驗從健康的草魚腸道中分離原籍乳酸菌，確保菌株能很好地適應草魚腸道的環境，發揮菌株的益生性，并對其生長、耐酸、耐鹽能力進行分析，旨在篩選出性能穩定、益生性好的菌株，為以后研究發酵中草藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚試驗用草魚來自江西省水產科學研究所試驗基地魚池，平均體重約為450 g，體質健壯。

1.1.2 培養基與試劑MRS 液體培養基、MRS 固體培養基、TaKaRa 細菌基因組DNA 提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司、16SrDNA 基因引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成、藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司、HCl、NaOH、膽鹽等。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸道乳酸菌的分離草魚腸道乳酸菌分離在超凈工作臺內進行。將魚放在白色托盤中，用75%酒精擦拭魚體表，剖開魚腹，取出腸道。縱向剪開腸道，用PBS 緩沖液沖洗掉腸內糞便，取少許腸道剪碎并用無菌生理鹽水沖洗2～3 次，放入MRS 液體培養基中30℃富集培養24 h。將富集培養液按 10-1 梯度稀釋至10-7 ，各取100 μL 稀釋液涂布含1% CaCO3的MRS固體培養基，30℃倒置培養48 h。挑取有溶鈣環的單菌落，再次劃線接種于MRS 固體培養基純化。取2次純化后的菌落進行革蘭氏染色。

1.2.2 細菌的16S r DNA 序列測定按TaKaRa 細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，并以其為模板進行 PCR 擴增，引物為通用引物，反應體系為25 μL 體系。擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對。

1.2.3 耐酸、耐膽鹽能力測試將鑒定為乳酸菌的菌株進行耐酸、耐膽鹽能力測試試驗，測試方法參照向雙云[6]的方法進行。

耐 酸 能 力 測 試 用1mol/L 的HCl 和1 mol/L 的NaOH將MRS液體培養基的pH值分別調節成2.0、3.0、4.0 共3 個處理組，將菌株按1%的接種量分別接種于3 個處理組中，每個處理組設3 個平行，30℃處理3 h，以不調節pH 值的MRS 液體培養基為對照。處理完畢后，每個處理組和對照組的菌液10 倍稀釋至合適的稀釋度，取3 個合適稀釋度菌液100 μL 分別涂布于MRS固體培養基，30℃培養24 h后計數菌落數，記錄結果，每個處理計算平均菌落數。試驗結束后按公式（1）計算乳酸菌的存活率。

存活率（%）=（處理組平均活菌數 / 對照組平均活菌數）×100 （1）

耐膽鹽能力測試 在MRS 液體培養基中分別加入0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽鹽后成3 個處理組，將菌株培養24 h 后的菌液按5%（v/v）接種于3 個處理組中，每個處理設3 個平行，30℃處理3 h，以不添加膽鹽的MRS 液體培養基為對照。處理完畢后，按耐酸能力測試的方法進行平板菌落計數，計算乳酸菌的平均存活率。

1.2.4 生長曲線測定將耐酸、耐膽鹽能力強的菌株按1%的比例接種于MRS 液體培養基，30℃培養24 h，設3 個平行。從第2 h 開始，每隔2 h 取樣測定其OD600，以MRS 液體培養基為空白對照，記錄數據繪制生長曲線。

1.2.5 安全性測試將待測乳酸菌接種于MRS 液體培養基，30℃培養12 h 至指數期后，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用無菌生理鹽水重懸，再離心洗滌一次，最后制成濃度為108 CFU/mL 的菌懸液。選取體重為50.5±4.5 g 的健康草魚，分成10 尾一組。試驗組每尾草魚經胸鰭基部注射0.2mL 菌懸液，設3個平行，對照組注射0.2 mL 無菌生理鹽水。注射后連續觀察7 d，統計各組草魚的存活狀況。

1.2.6 抑菌能力測試測試方法參照向雙云[6]的方法設計。選取大腸桿菌和維氏氣單胞菌為指示菌。在營養瓊脂平板上注入0.1 mL 指示菌菌液，用涂布器涂布均勻。在培養基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養基表面接觸無空隙。在杯中加入待測菌菌液，每株菌液做3 個平行。置于4℃冰箱中處理1 h后，再30℃培養24 h，觀察結果。以牛津杯周圍沒有肉眼可見細菌生長區域為抑菌圈，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，取3 個平板的平均值。根據抑菌圈平均值判斷乳酸菌對大腸桿菌的敏感性。抑菌圈直徑小于10 mm 為不敏感，10～15 mm 為中度敏感，15 mm 以上為高度敏感。

1.2.7 藥敏測試按上述安全性測試的方法將待測菌株制成濃度為106 CFU/mL 的菌懸液，取100 μL 分別涂布于MRS 固體培養基上。采用藥敏紙片擴散法，將紙片無菌操作均勻置于培養基上，30 ℃培養24 h 后，測量各藥敏紙片抑菌圈的直徑，重復3 次試驗。根據敏感性標準判定各藥物對菌株的敏感性。

1.3 數據統計分析

試驗數據用平均值±標準差表示，采用統計軟件SPSS16.0 對數據進行單因素方差分析，并進行顯著性檢驗，P＜0.05 為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

從草魚腸道中分離出12 株乳酸菌，它們在MRS平板上的形態基本一致，均為圓形，乳白色，表面光滑濕潤，革蘭氏染色判定為陽性菌。16S r DNA序列測序結果顯示，其中8 株乳酸菌屬于乳球菌屬（Lactococcus），分別是6 株乳酸乳球菌（L.lactis），2 株格氏乳球菌（L.garvieae），4 株腸球菌屬（Enterococcus），均為糞腸球菌（E.faecalis）。格氏乳球菌為致病菌，乳酸乳球菌和糞腸球菌為益生菌，因此，選取2 株具有較強產酸能力的乳酸乳球菌（CR1、CR2）和2 株糞腸球菌（CR3、CR4）進行益生效果評價。

2.2 乳酸菌生長曲線

從圖1 可以看出，試驗選取的4 株乳酸菌均于4 h 后進入對數生長期，OD600值快速上升，8 h 后生長達到高峰，進入生長穩定期。乳酸乳球菌CR1、CR2生長速率較糞腸球菌CR3、CR4 快，且4 h 后差異顯著（P＜0.05），表明乳酸乳球菌CR1、CR2 的生長性能相對較好。

圖1 乳酸菌的生長曲線

2.3 乳酸菌耐酸能力測定

從圖2 可以看出，試驗選取的4 株乳酸菌在pH值為4.0 的條件下存活率均在80%以上，差異不顯著（P＞0.05），隨著pH 值的降低，菌株的存活率均顯著下降，在pH 值為2.0 的條件下，菌株CR1、CR2、CR3 的存活率平均為26%、22%、30%，差異不顯著（P＞0.05），菌株CR4 的存活率為0，顯著低于CR1、CR2、CR3（P＜0.05），表明CR4 對酸的耐受能力較弱。

圖2 乳酸菌對酸的耐受試驗

2.4 乳酸菌耐膽鹽能力測定

從圖3 中可以看出，試驗選取的4 株乳酸菌存活率隨膽鹽濃度增加而降低，其中，菌株CR2 的存活率顯著低于CR1 和CR3（P＜0.05），在膽鹽濃度增加到0.3%時，CR2 的存活率低于10%，表明菌株CR2 對膽鹽耐受能力較差。

圖3 乳酸菌對膽鹽的耐受試驗

2.5 乳酸菌安全性測定

注射乳酸菌菌懸液后，4 株乳酸菌試驗組和對照組草魚都未出現死亡，將試驗魚解剖，發現試驗組和對照組草魚內臟均正常無病變，表明4 株乳酸菌都安全。

2.6 乳酸菌抑菌能力測試

從表1 中可以看出，4 株乳酸菌對大腸桿菌均表現了高度敏感的抑制效果。CR1 和CR4 對維氏氣單菌也表現出了高度敏感的抑制作用，CR2、CR3 對維氏氣單菌為中度敏感。

表1 4 株乳酸菌菌株的抑菌能力測試結果

2.7 乳酸菌藥敏測試

從表2 中可以看出，4 株乳酸菌對不同的抗生素表現出了不同的敏感性。菌株CR1 對9 種抗生素中的7種敏感，對恩諾沙星中度敏感，僅對丁胺卡那耐藥。CR2、CR3 和CR4 等3 株菌株都僅對其中4～5 種抗生素敏感，對恩諾沙星、頭孢他啶和丁胺卡那都表現出不同程度的耐藥性。

表2 乳酸菌藥敏測試結果

3 討 論

3.1 乳酸菌分離鑒定

乳酸菌是水產動物消化道中的亞優勢種，具有調節腸道菌群、增強機體免疫力等益生作用[7-9]。目前已有較多研究從魚腸道中分離得到乳酸菌，如楊媛媛等[10]從健康鯽魚腸道內分離鑒定出38 株乳酸菌，分別屬于乳球菌屬、明串珠菌屬、肉食桿菌和腸球菌屬；Soltani 等[11]從波斯鱘的腸道中分離鑒定出47 株乳酸菌，分別為乳酸乳球菌、韋斯氏菌、戊糖片球菌和糞腸球菌；Ring 等[12]從大西洋鮭魚、嘉魚等4 種魚腸道中分離鑒定出11株乳酸菌株，均屬于肉食桿菌。從以上研究中看出，不同的魚腸道中分離出的乳酸菌有些相同有些也存在差異，本研究從草魚腸道中分離出的12 株乳酸菌分別屬于乳球菌屬和腸球菌屬，與以上的研究也不盡相同，這可能是由于研究者的研究方法存在差異，也與魚類的食性以及生存環境有很大的關系。

3.2 乳酸菌生長特性

腸道中乳酸菌只有達到一定數量的時候，才能改善和調節宿主體內微生物菌群的平衡，產生對宿主健康有益的作用[13]，不同來源的乳酸菌的生長速度會有差異，同一來源的乳酸菌由于菌株本身的特性，在生長速度上也會有所不同[6]，所以生長速度也是乳酸菌產生作用的重要條件之一。楊靜等[14]研究表明植物乳桿菌及糞腸球菌分別培養了6 h 和8 h 后進入對數生長期，分別于18 h 和16 h 后吸光值達到最大；王紅濤[15]的研究也發現干酪乳桿菌與屎腸球菌分別于4 h和8 h 進入對數生長期，分別于30 h 和12 h 后進入穩定期。研究中選取的乳酸菌于4 h 后進入對數生長期，8 h 后進入生長穩定期，對比上述研究來看生長速度均比較快。4 株乳酸菌中CR1、CR2 生長速率較CR3、CR4 快，表明CR1、CR2 顯示了更好的生長特性。

3.3 乳酸菌耐酸耐膽鹽

耐酸和耐膽鹽能力是影響乳酸菌發揮益生功效的重要影響因素，乳酸菌必須具有較強的耐酸能力才能順利通過胃中的酸性環境而到達腸道中發揮其益生功能[16]，進入小腸將會面臨高濃度的膽鹽環境，高濃度膽鹽會破壞細胞膜正常結構，導致膜蛋白解離，使細胞內容物滲漏而造成細胞死亡[17]。從耐酸耐膽鹽試驗結果可以看出，從草魚腸道分離出的乳酸菌都能很好的適應腸道環境，但在低pH 值以及高膽鹽脅迫下，菌株的耐酸耐膽鹽能力還是會出現顯著差異，這與鄒建華等[18]的研究結果相似。

3.4 乳酸菌抑菌能力

對致病菌的抑制作用也是評價乳酸菌產生作用的重要條件之一。乳酸菌會產生大量的有機酸、過氧化氫、細菌素等多種物質來抑制致病菌的生長[19-20]，同時促進腸道蠕動，加速病原菌排除體外[21-22]，從而可以起到調節腸道微生物生態平衡、維護腸道健康等作用。Sahoo 等[23]研究從南亞野鯪和真卡特拉鲃腸道分離獲得的5 株乳酸菌的抑菌能力，發現其對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等8 株指示菌均有很強的抑制作用；高擎等[24]研究報道，11 株乳酸菌對大腸桿菌 K88、K99、雞白痢沙門菌指示菌均有不同程度的抑制作用。本研究用大腸桿菌和維氏氣單胞菌對4 株乳酸菌進行抑菌能力測試，結果顯示4 株菌株對大腸桿菌均有很強的抑制作用，CR1 和CR4 對維氏氣單菌也表現出了高度敏感的抑制作用，CR2、CR3 對維氏氣單菌僅為中度敏感。說明從草魚腸道分離的4 株乳酸菌和其他大部分乳酸菌一樣，對常見病原菌具有抑制作用。

3.5 乳酸菌藥敏測試

耐藥性評價是益生乳酸菌應用安全性評價的首要內容[25]。乳酸菌的耐藥性有其有利的一面，如乳酸菌和抗生素一起使用時，可使乳酸菌存活于宿主腸道，幫助宿主恢復腸道菌群平衡[26]。但其耐藥基因可以各種方式在腸道菌群間相互傳遞，從而導致致病菌也獲得耐藥性，危害宿主健康[27]。該研究分離的4 株乳酸菌對不同的抗生素表現出了不同的敏感性。菌株CR1對9 種抗生素中的7 種敏感，對恩諾沙星中度敏感，僅對丁胺卡那耐藥。CR2、CR3 和CR4 等3 株菌株都僅對其中4～5 種抗生素敏感，對恩諾沙星、頭孢他啶和丁胺卡那都表現出不同程度的耐藥性。近年來，抗生素和有益菌的聯合或配合應用已成為飼料添加劑研究的熱點。恩諾沙星是目前水產養殖生產中較常用于治療細菌性疾病的內服藥，研究分離的乳酸菌對恩諾沙星存在一定程度的耐藥性，在治療過程中不會被殺滅，可作為益生菌應用到實際生產中。

4 結 論

從草魚腸道分離了4 株乳酸菌，對其生長速度、耐酸、耐膽鹽、安全性、抑菌能力和藥物敏感度進行測試。結果表明4 株乳酸菌中，乳酸乳球菌CR1 具有較好的益生特性，可作為發酵漁用中草藥飼料添加劑的益生菌。