結(jié)膜松弛癥結(jié)膜組織中彈力纖維結(jié)構(gòu)蛋白和交聯(lián)酶的表達

干靜云 李青松 詹月萍 符之瑄

【關(guān)鍵詞】結(jié)膜松弛癥;彈力纖維;彈力蛋白;原纖蛋白-1，賴氨酰氧化酶

【中圖分類號】G644.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2022）03--01

結(jié)膜松弛癥是一種與年齡相關(guān)的疾病，因松弛及非水腫性的球結(jié)膜堆積在眼球和下眼瞼之間而引起[1]。透射電鏡下，彈性纖維由徑向排列的微纖維束圍繞無定型的彈性蛋白核心構(gòu)成[2]。彈性蛋白原通過交聯(lián)而組裝成彈性蛋白，微纖維束則主要由原纖維蛋白家族[3]組成。當身體發(fā)生貧血時，紅骨髓造血功能會代償性亢進，以產(chǎn)生更多的紅細胞來糾正貧血。同理，我們提出彈性纖維也有類似的代償機制。

為此，我們檢測了結(jié)膜松弛癥患者結(jié)膜組織中彈性蛋白、原纖維蛋白-1、賴氨酸氧化酶的表達。有趣的是，檢測結(jié)果與假設(shè)并不相符。

方法和材料：

共收集結(jié)膜組織標本12例，標本全部來自右眼，其中6例來自對照組;6例來自CCh組。CCh的診斷基于張興儒提出的診斷標準。手術(shù)方法均選用新月形切除術(shù)。

免疫組織化學方法：將石蠟切片在65℃的恒溫烘箱中放置30 min。然后在二甲苯溶液中脫蠟。將脫蠟的載玻片分別置于100%乙醇，95%乙醇，85%乙醇和75%乙醇中5 min，然后用自來水洗滌10 min。將水合的載玻片在高壓下置于檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）中15 min，自然冷卻后，將其用0.02 M PBS洗滌3分鐘x 3次。然后將載玻片置于3%H2O2溶液中約10 min，并用0.02 M PBS溶液沖洗3分鐘x 3次。將一抗添加至玻片（選擇最佳稀釋比例），在濕盒中孵育，然后在室溫下放置1小時。用0.02M PBS沖洗載玻片3 min×3次。將HRP標記的廣譜二抗添加至玻片，在濕盒中孵育，并在室溫下靜置20-30分鐘，然后用0.02 M PBS沖洗3 minx 3次。載玻片用DAB染色，當其顏色改變時，立即用自來水清洗。用蘇木精對載玻片復染色，然后使其透明并密封。

總計進行了彈性蛋白，原纖維蛋白-1和LOX的免疫組織化學染色。在一抗孵育的實驗步驟中，需要分別添加相應(yīng)的抗體，其余步驟完全相同。抗彈性蛋白（代ab21610）纖維蛋白-1（代碼ab53076）和LOX（代碼ab31238）的一抗來自英國的ABCAM公司。

在200倍顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色和醛紅色染色的標本的細胞和彈性纖維的形態(tài)。在200倍顯微鏡下拍攝免疫組織化學染色的石蠟切片，并從每個切片中拍攝三個不同部分的照片。使用Image-Pro-Plus 6.0軟件分析照片，并使用三個不同部分的光密度值的平均值代表結(jié)膜組織中每種蛋白質(zhì)的含量。

使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。測量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。

本研究遵循赫爾辛基宣言，均取得上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院倫理委員會批準及患者的知情同意。

結(jié)果：

CCh組的6例患者中，男性3例，女性3例，年齡64-83歲（72.55±6.51）。對照組的6例患者中，男性2例，女性4例，年齡65-79歲（69.66±5.64）。

在200倍的顯微鏡下觀察HE染色的結(jié)膜組織，可見其上皮層為深紅色，上皮細胞核為藍色。對照組（A）的上皮層為扁平上皮細胞。相反，CCh組（B）的上皮層的層數(shù)明顯增加，并伴有角化不全（圖1）。

討論：

免疫組化結(jié)果表明和對照組比較，CCh患者結(jié)膜組織中結(jié)構(gòu)蛋白Elastin、Fibrillin-1的表達是降低的。Elastin由可溶性的前體-彈力蛋白原互相交聯(lián)裝配而成。在彈力蛋白原被釋放到細胞表面之前，彈力蛋白結(jié)合蛋白和彈力蛋白原結(jié)合，防止它在形成彈力蛋白前被破壞。它構(gòu)成彈力纖維的無定型蛋白核心。

結(jié)膜固有層中彈力纖維破壞后明顯減少可引起球結(jié)膜彈性下降、張力降低。進而球結(jié)膜與眼球的附著力下降，在下瞼緣的反復擠壓下形成皺褶。結(jié)膜皺褶突出于眼球表面曲面，影響眼淚的流動和淚河的形成。引起CCh患者的淚液排泄延緩和清除延遲。淚液清除延遲反過來又導致淚液中上述炎癥因子大量堆積，如此形成惡性循環(huán)，最終導致結(jié)膜松弛不斷地加重和進展。

由上可知，目前對CCh發(fā)病過程的認識著重點在于彈力纖維的破壞、降解、變性。本研究的結(jié)果提示CCh發(fā)病機制不僅僅局限于彈力纖維降解的一面，還存在彈力纖維的合成不足的一面，實驗結(jié)果表明和對照組比較，CCh患者結(jié)膜組織中交聯(lián)酶Lox的表達是無差異的。賴氨酰氧化酶是一種銅依賴性胺氧化酶，其家族共有五個成員：Lox和賴氨酰氧化酶樣蛋白1-4（LOX-like proteins 1-4，Loxl1-4）。

LOX具有穩(wěn)定細胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細胞表型、抗腫瘤和趨化作用。Elastin和膠原蛋白是LOX家族的特征性生理底物。通過此作用使Elastin和膠原蛋白發(fā)生共價交聯(lián)成彈力纖維和膠原纖維，彈力纖維和膠原纖維在LOX的作用下進一步發(fā)生共價交聯(lián)成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。共價交聯(lián)為彈力纖維和膠原纖維提供大部分拉伸強度和結(jié)構(gòu)完整性。實驗結(jié)果意味著它大概率并不涉及在CCh的發(fā)病機制中。

雖然參與彈力纖維合成的蛋白質(zhì)分子很多，但Elastin、Fibrillin-1、Lox在彈力纖維的裝配中起比較重要的作用。此外，研究成本和研究者的精力的限制使得它們被選作研究對象。

人體結(jié)膜組織菲薄，手術(shù)切除得到的離體標本分量少，組織勻漿的量不足以進行蛋白質(zhì)印跡法的檢測。它也不符合酶聯(lián)免疫吸附試驗的檢測條件。因為免疫組化法可對蛋白進行定性和定量研究，且特異性強，敏感性高，對目標蛋白的行定位準確，對組織標本的大小無特殊限制和要求，最終本研究采用免疫組化法檢測Elastin、Fibrillin-1、Lox在結(jié)膜組織中的表達。

參考文獻：

[1]Hughes WL.Conjunctivochalasis[J].Am J Ophthalmol.1942;25：48-51.

[2]Gan JY，Li QS，Zhang ZY，et.al.The role of elastic fibers in pathogenesis of conjunctivochalasis[J].Int J Ophthalmol.2017;10（9）：1465-1473.DOI：10.18240/ijo.2017.09.21

[3]A.GARNER，R.A.ALEXANDER.Histochemistry of elastic and related fibres in the human eye in health and disease[J].Histochem J.1986;18：405-412.

*通訊作者：李青松（1969，11）女，博士，主任醫(yī)師，眼科主任，研究方向：眼表淚液學。

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