參附注射液誘導H9C2大鼠心肌細胞熱休克蛋白22表達并減輕缺氧/復氧損傷的研究*

曾圣強，歐陽長生，王 洪，洪德志，譚文亮，徐成偉，劉子銘，王云霞

(江西省人民醫院，南昌 330006)

目前各種血運重建技術可及時有效地恢復心肌血流灌注，減輕心肌缺血損傷及壞死。然而心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷仍然嚴重制約著急性心肌梗死患者的預后。近年來藥物性預處理及其作用機制研究已成為熱點,中醫藥防治心肌I/R損傷的研究取得了一定進展。多項研究證實參附注射液(Shenfu Injection,SFI)對心肌I/R損傷有明顯保護作用，具有缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)效應[1-2]。既往研究均認為SFI的IPC效應可能與誘導熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表達相關[3-7]，但未能證實SFI的IPC效應與HSP70直接相關。由于HSP70表達受到熱休克蛋白22(heat shock protein 22,HSP22)調控，多項研究已證實HSP22具有重要的抗心肌I/R損傷作用，該保護作用等同于IPC。HSP22作為一種較新的熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)，在心肌I/R損傷中的作用日益受到關注。SFI同樣具有IPC效應，它對HSP22的作用尚不清楚。本研究通過體外培養大鼠心肌細胞，予以缺氧/復氧(anoxia/reoxygenation,A/R)處理模擬心肌I/R損傷，觀察SFI對A/R損傷大鼠心肌細胞HSP22表達的影響，探討參附注液對A/R損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

大鼠H9C2心肌細胞購自中國科學院細胞庫。H9C2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃飽和濕度、含5% CO2的孵箱中培養。取處于對數生長期、生長狀態良好的H9C2細胞用0.25%胰酶消化后，進行細胞計數。

1.2 儀器與試劑

DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，Trizol購自美國Invitrogen公司(貨號GT1402)，RIPA裂解液(強)、BCA蛋白定量試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，RNase抑制劑(貨號E00381)、三磷酸脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotides,dNTPs)(貨號GD1102)、RevertAid逆轉錄酶(貨號EP0441)購自美國賽默飛世爾科技公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購自美國KPL(貨號分別為074-1806、074-1506)，兔抗人HSP22一抗(貨號3059S)購自美國CST公司，β-actin (貨號66009-1-lg)購自美國Proteintech公司，Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)購自美國Genview公司(貨號GR1201)，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑購自廣州鼎國生物技術有限，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水(貨號40718)購自美國Sigma公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的Annexin V(Annexin V-FITC)及碘化丙錠(propidium iodide,PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Biolegend公司，ECL化學發光試劑盒(貨號SQ201)購自上海雅酶生物科技有限公司，參附注射液購自北京雅安三九藥業有限公司。

CO2恒溫培養箱購自美國美國賽默飛世爾科技公司，7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)儀購自美國應用生物系統公司，Clinx Chemi Scope 6000化學發光儀購自上海勤翔科學儀器有限公司，Nano-200超微量核酸分析儀購自杭州奧盛儀器有限公司，流式細胞儀購自美國BD公司(型號FACSCalibur)，DYCZ-24DN雙垂直電泳儀、DYCZ-40DN轉印電泳儀(槽)均購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1A/R損傷模型的建立及分組

取處于對數生長期的H9C2細胞，接種于6孔培養板；每孔3×105個細胞，每孔最終的培養基總量2 mL；分為5個組(n=3)：對照組、A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組。按照分組加入1.5% SFI，2.5% SFI，3.5% SFI在37℃、5% CO2培養箱中培養24 h；在5%CO2和95%N2條件下培養6 h，95%空氣和5%CO2條件下繼續培養2 h(根據MTT檢測確定最佳復氧時間為2 h)后，收樣檢測。

1.3.2MTT 比色法檢測各組細胞存活率

取處于對數生長期、生長狀態良好的H9C2細胞接種到96孔板中，密度為1×104/孔，分組為：對照組，A/R(0 h) 組，A/R(2 h) 組，A/R(4 h) 組，A/R(8 h) 組，A/R(16 h) 組；按照分組在5% CO2和95% N2條件下培養6 h，95%空氣和5%CO2條件下分別培養0 h、2 h、4 h、8 h、16 h。各組細胞在檢測時間點時，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2培養箱中培養4 h；吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL 二甲基亞砜。用酶標儀于波長490 nm處測定各孔吸光度(A)值，以得到的A值反映各組H9C2細胞的增殖能力。

1.3.3流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡率

各組細胞離心收集；用4 ℃預冷PBS洗滌2次，然后用500 μL結合緩沖液重懸細胞，調節其濃度為106/mL；然后取100 μL細胞懸浮于5 mL流式管中，加入Annexin V-APC和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色，于室溫避光孵育15 min；加樣于流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.4熒光定量RT-PCR檢測各組心肌細胞HSP22 mRNA表達

分別收集各組細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA。以超微量核酸分析儀測定RNA純度和濃度，選取合格RNA樣品逆轉錄合成cDNA。以稀釋的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR。引物設計見表1。擴增程序設置：95 ℃ 預變性 3 min、95 ℃ 變性15 s，11個循環，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環，記錄熔解曲線，擴增產物4 ℃保存。應用2-ΔΔCt法分析各組HSP22 mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.3.5HSP22蛋白表達的 Western blot 檢測

各組細胞離心收集；加入細胞裂解液，置冰上提取各組細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，采用金屬浴致蛋白變性。取30 μg蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后電轉至硝酸纖維素膜上。將膜移至5%BSA封閉液中封閉1 h；特異性一抗用含5%BSA溶液稀釋至適當濃度(根據抗體說明書提供的稀釋比)；4 ℃孵育過夜后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次；二抗用1×PBST溶液稀釋至適當濃度(根據抗體說明書提供的稀釋比)，室溫下孵育1～2 h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次，進行化學發光反應。加入ECL化學發光液，顯影、定影，凝膠成像系統成像拍照，采用Quantity One圖像分析軟件，以β-actin為內參，計算各組H9C2細胞中HSP22蛋白的表達水平。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 復氧2 h后心肌細胞的增殖受到明顯抑制

MTT檢測結果顯示，復氧2 h、4 h、8 h后H9C2心肌細胞增殖率顯著降低；復氧2 h后H9C2心肌細胞增殖率均顯著低于其他各組，見表2。故后續試驗均采用復氧2 h建立A/R模型。

表2 各組H9C2心肌細胞增殖率

2.2 SFI顯著降低A/R損傷誘導的H9C2心肌細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比較，A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，提示A/R損傷可誘導心肌細胞凋亡；與A/R組相比較，A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組細胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)，表明低中高濃度SFI均顯著降低A/R損傷誘導的心肌細胞，見表3、圖1。

表3 各組H9C2心肌細胞凋亡率

A:對照組；B:A/R組；C:A/R+1.5% SFI組；D:A/R+2.5% SFI組；E：A/R+3.5% SFI組。

2.3 SFI對H9C2心肌細胞HSP22 mRNA表達的影響

熒光定量RT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22 基因mRNA的表達水平均顯著下降(P<0.05)；與A/R組相比，A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22 基因mRNA的表達水平均無明顯改變，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組H9C2心肌細胞HSP22 mRNA相對表達量

2.4 SFI對H9C2細胞HSP22蛋白表達的影響

Western blot 檢測結果顯示，與對照組相相比較，A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22蛋白相對表達量顯著下降(P<0.05)；與A/R組相比較，A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)；A/R+3.5% SFI組HSP22蛋白相對表達量顯著高于A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組(P<0.05)，見圖2、表5。

1：對照組；2：A/R組；3：A/R+1.5% SFI組；4：A/R+2.5% SFI組；5：A/R+3.5% SFI組。

表5 各組H9C2心肌細胞HSP22蛋白相對表達量

3 討 論

急性心肌梗死是全球范圍內致死和致殘的重要疾病之一。在過去20余年，通過藥物或血運重建技術恢復心肌血流灌注，可顯著減輕心肌缺血壞死，已成為治療急性心肌梗死的標準程序[8]。然而缺血心肌血流再灌注后，受損心肌功能并未得到恢復，心肌損傷反而進一步加重，甚至出現梗死面積擴大等不可逆損傷，該現象稱為心肌I/R損傷[9]。目前臨床上仍然無法有效避免心肌I/R損傷，嚴重影響著患者預后[10]。

SFI組方來源于中醫著名古方“參附湯”[11]，主要成分是人參皂甙和烏頭類生物堿[12]，能顯著增加血管灌注量、改善心肌能量代謝，具有抗凋亡、抗炎、抗心肌I/R損傷等作用[11,13-16]。本研究通過建立H9C2大鼠心肌細胞A/R損傷模型，應用不同濃度SFI預處理心肌細胞，發現隨著SFI濃度升高可顯著減輕A/R損傷誘導的心肌細胞凋亡，表明SFI具有減輕H9C2大鼠心肌細胞A/R損傷的抗凋亡作用。

既往研究發現SFI的多器官保護作用與誘導HSPs相關。SFI預處理可增加HSP70表達并減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，具有IPC效應[4]。王峰等[5]通過建立大鼠心肌I/R損傷模型，觀察到SFI預處理可誘導HSP70 mRNA及其蛋白的表達，并發揮抗心肌I/R損傷作用。陳玉培等[7]同樣觀察到在大鼠心肌I/R損傷模型中，SFI預處理可誘導心肌HSP70表達上調，同時還可增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、減少丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成，具有抗氧自由基及抗脂質過氧化反應的心肌保護作用。因此，既往研究認為SFI的IPC效應可能與誘導HSP70表達相關，但并未證實SFI的IPC效應與HSP70直接相關。由于HSP70在細胞受到應激刺激后生成明顯增多，以往研究多關注于SFI對HSP70 的誘導表達作用。由于HSP70 的表達受到HSP22的調控，HSP22可誘導HSP70表達上調[17-18]，提示HSP22可能在SFI的IPC效應中有重要作用。

熱休克蛋白是機體細胞在應激狀態下誘導產生的一類重要的內源性保護蛋白，主要通過“管家”作用使受損蛋白恢復正常結構和功能，促進細胞存活[19]。其中相對分子質量為(12～43)×103的熱休克蛋白被稱為小熱休克蛋白(small heat shock proteins,sHSPs)[17]。HSP22又稱HSPB8、H11K，屬于sHSPs超家族成員之一[17]，在改善心肌細胞線粒體能量代謝[17,21]、抗心肌缺血[17-18,22-23]、抑制心肌重構[22,24]及抗心肌細胞凋亡[18,25]等方面有著積極的作用。

研究證實HSP22具有抗心肌I/R損傷作用，其保護作用等同于IPC[18,26]。DEPRE等[18]發現HSP22過表達小鼠與IPC小鼠心肌梗死面積無明顯差異，HSP22可激活參與IPC效應的主要生存激酶，包括Akt及AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]。HSP22直接與Akt和AMPK結合，并激活來自細胞質和細胞核的存活機制，主要包括抑制促凋亡效應因子(糖原合酶激酶3β、Bad及 Foxo)，激活抗凋亡效應子(PKCε、內皮和誘導型NO合酶亞型以及HSP70)，上調缺氧誘導因子1的表達及促進基因組向葡萄糖利用的轉換。因此，HSP22激活生存途徑可預先觸發對缺血的抗凋亡和代謝反應，并賦予完全等同于IPC的心臟保護作用。

在本研究中，與對照組相比，A/R組大鼠心肌細胞HSP22 mRNA及HSP22蛋白表達均明顯下調，同時細胞凋亡率顯著增加。A/R損傷時，SFI可顯著增加大鼠心肌細胞HSP22蛋白的翻譯并減輕細胞凋亡，但對HSP22 mRNA的轉錄無明顯影響，表明SFI可能通過促進HSP22表達發揮抗大鼠心肌細胞A/R損傷作用。既往研究證實在心肌I/R損傷中HSP22通過誘導HSP70表達上調及激活發揮IPC效應[17-18]，因此，筆者認為在心肌I/R損傷中，SFI對HSP70的誘導表達作用可能受到HSP22的調控，HSP22在SFI的IPC作用中起關鍵作用。

SFI對大鼠心肌細胞的保護作用與濃度相關。在SFI干預實驗中，本研究分別使用濃度為1.5%、2.5%及3.5%的SFI預處理心肌細胞，觀察到SFI可減少A/R損傷誘導的心肌細胞凋亡，并且A/R+2.5%SFI組心肌細胞凋亡率顯著低于A/R+1.5%SFI組及A/R+3.5%SFI組，表明2.5% SFI抗心肌細胞凋亡作用最強，因此體外實驗中SFI培養大鼠心肌細胞的最適宜濃度為2.5%。同時本研究還觀察到SFI對HSP22的誘導表達作用呈濃度依賴性。

本研究中與對照組相比,A/R組H9C2心肌細胞HSP22 mRNA和蛋白表達顯著下調,而細胞凋亡率顯著升高。然而，筆者觀察到 HSP22 在 SFI 給藥后蛋白質水平上調，但 mRNA 水平上調。 SFI可顯著增加H9C2細胞中HSP22蛋白的翻譯，但對HSP22 mRNA的轉錄無顯著影響。Western blot結果與PCR結果不一致可能有3個原因：首先，基因表達分為轉錄和翻譯水平，即mRNA水平和蛋白質水平。 HSP22表達的轉錄和翻譯的時間和位點之間存在時間和空間差距；其次，轉錄后會進行轉錄后加工、轉錄產物降解、翻譯、翻譯后加工和修飾。 SFI 可能作用于 HSP22 表達的翻譯水平。最后，不同的檢測時間點也可能導致結果不一致。

本研究尚存在一定的不足。首先，僅通過心肌A/R損傷細胞模型得到體外實驗結果，其證明力度還不夠充分，有待在心肌I/R損傷動物模型的體內實驗中進一步驗證；其次，I/R損傷是通過多種信號通路作用，下游信號分子可以重疊，僅研究單一信號通路不夠全面，本實驗尚不能證實SFI的抗心肌細胞A/R損傷作用與誘導HSP22表達直接相關，SFI是否通過HSP22調控HSP70表達尚有待進一步研究。

綜上所述，SFI在大鼠心肌細胞A/R損傷中可誘導HSP22表達上調，并減輕A/R損傷誘導的細胞凋亡，為臨床上應用SFI治療心肌I/R損傷提供了一定的理論依據。