IGF-1促進肺泡上皮細胞衰老致肺纖維化進展的分子機制研究*

赫 琪,肖偉利,曹銀芳,劉佳誼,梁子紅△

(1.內蒙古自治區人民醫院醫學檢驗科,呼和浩特 010017;2.內蒙古醫科大學附屬醫院血液科,呼和浩特 010017)

特發性肺纖維化普遍發病年齡在60歲以上,屬于難治性疾病,目前尚無有效的治療手段阻止其進展[1]。肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells,AECs)在持續微損傷環境下自身修復功能下降致肌成纖維細胞聚集是肺纖維化進展的核心事件[2]。研究表明在肺纖維化中AECs修復功能下降與細胞衰老有關,然而目前AECs衰老的原因、機制不明[3]。研究[4-5]發現：胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)是一類自然生長激素,在促進機體生長、發育中發揮重要作用,通過激活下游磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K) 及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;別名AKT),最終引發細胞衰老[4-5]。衰老后的AECs通過衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)釋放轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)促進AECs向肌成纖維細胞轉化及增加膠原的合成,最終加重肺纖維化[6-7]。筆者推測：IGF-1信號通路活化可能是AECs衰老致肺纖維化進展的重要機制,若能對IGF-1信號通路活性進行精準調控，有可能恢復AECs的修復功能及抑制肺纖維化進展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57小鼠,體重18～25 g,6～8周齡,購于內蒙古醫科大學實驗動物中心,動物合格證號NMGYKDX(蒙)2020-0534。根據隨機數字表法將小鼠分為2組,每組6只,分別為對照組(鹽水組)、博來霉素(BLM)組。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞株購于ATCC細胞庫；A549細胞用含有RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素混合溶液培養并置于37 ℃孵箱中進行孵育。

1.2.2主要實驗試劑

BLM購自海正輝瑞制藥有限公司；IGF-1購自北京索萊寶生物公司。HE染色試劑盒和戊巴比妥鈉購自上海碧云天生物技術有限公司；RNA純化試劑盒購自QIAGEN；其他生化試劑均購自北京索萊寶生物公司。

1.2.3肺纖維化小鼠模型建立

充分麻醉后,向小鼠氣管內一次性滴入實驗用量的 BLM(5 mg/kg)構建肺纖維化模型。向對照組小鼠氣管內滴入等量的生理鹽水,記為第0天,常規自由飲食；第21天腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠,并分別收集兩組小鼠的肺組織。取部分肺組織于4%多聚甲醛固定24 h后,制作石蠟切片,用于HE染色和Masson染色；剩余肺組織經液氮速凍后,保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4小鼠肺組織免疫組織化學染色

石蠟切片用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟,不同濃度乙醇(100%、95%、80%、70%)脫水后,用微波抗原修復法對石蠟切片進行抗原修復。修復完成后滴加工作封閉山羊血清對樣本進行封閉(時間30 min)。封閉結束后孵育一抗過夜。次日依據北京中杉金橋公司的過氧化物酶標記羊抗兔/鼠試劑盒說明書,分別滴加SP試劑(鏈霉親和素-過氧化物酶),進行DAB顯色、蘇木素復染等操作，并在顯微鏡下觀察評分。IGF-1主要表達于腺體細胞的細胞質及細胞膜,以細胞質及細胞膜出現淡黃色、黃色、棕黃色為陽性，按陽性細胞比例計分:<10%為0分,10%～30%為1分,>30%～60%為2分,>60%為3分;按染色強度計分:無色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。將兩項計分相乘,0、1～3、4～6、7～9分別記錄為-、+、++、+++。這些得分也可以表述為≤3分為表達陰性(-),>3分為表達陽性(+)。切片均經2名有經驗的病理科醫師在雙盲情況下分別閱片。

1.2.5細胞免疫熒光

將正常培養的A549細胞株傳代至24孔板爬片中。PBS清洗3次后,4%多聚甲醛固定、0.1%Trition破膜后用山羊血清進行封閉,孵育一抗(4 ℃冰箱過夜)。次日孵育二抗,時間2 h。DAPI染核、封片，并于激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋白的表達情況。

1.2.6IGF-1檢測

ELISA法測定小鼠肺組織中 IGF-1的水平。

1.2.7mRNA檢測

根據實驗分組將不同處理方法的A549細胞用細胞裂解液進行裂解并提取總RNA,用紫外分光光度計測定各組RNA濃度；嚴格按照TaKaRa公司的反轉錄試劑盒操作步驟進行操作,以此獲得反轉錄后的cDNA；檢測各組細胞樣本中PI3K、AKT的mRNA的表達水平(PI3K:F-GAAAAGTTTGGCCGGTTCCG、R-GCAGTCAACATCAGCGCAAA;AKT:F-CTTTCGGCAAGGTGATCCTG、R-GTACTTCAG GGCTGTGAGGA;GAPDH:F-TGACTTCAACA GCGACACCCA、R-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA)。

1.2.8細胞免疫印跡

將上述所得的各組處理后的組織樣本用RIPA細胞裂解液提取總蛋白并進行蛋白定量檢測。選取各組蛋白20 μg進行上樣,SDS-PAGE蛋白凝膠電泳和轉膜。結束后根據蛋白相對分子質量準確裁剪目的蛋白條帶,并用0.4% 明膠進行封閉,時間30 min。封閉結束后孵育一抗,4 ℃孵育過夜。次日,PBST 緩沖液清洗3次,隨后用HRP標記的抗人源 IgG二抗室溫孵育1.5 h,再次用PBST緩沖液清洗,最后曝光并對其進行分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 IGF-1在BLM小鼠肺組織中廣泛表達

HE、Masson染色結果顯示：與對照組的肺臟病理相比,BLM小鼠肺臟間質中細胞數量增多、藍染的膠原纖維增加。免疫組織化學結果顯示：與對照組(-/+)相比,BLM小鼠肺臟中IGF-1的表達(+++)明顯上調,見圖1。

圖1 正常小鼠肺組織與BLM小鼠肺組織中IGF-1的表達(×200)

2.2 IGF-1可誘導肺泡上皮細胞發生衰老現象

IGF-1(10 ng/mL)刺激A549細胞72 h后,β-半乳糖染色(SA-β-gal)結果發現：與對照組相比,IGF-1刺激組衰老陽性的細胞數量明顯增多(P<0.05)。免疫熒光實驗結果發現：與對照組相比,IGF-1刺激組紅色熒光表達的P21、P16明顯上調(P<0.05)，見圖2。

A：SA-β-gal染色檢測各組衰老陽性細胞的數量；B：免疫熒光檢測各組P16、P21表達變化。紅色熒光代表P16、P21。

2.3 IGF-1上調了細胞衰老表型中TGF-β1、MMP-9的表達

ELISA法對A549細胞培養基進行了檢測,結果發現：與對照組相比,IGF-1刺激A549細胞72 h后的培養基中,TGF-β1、MMP-9的表達明顯上調(P<0.05)，見圖3。

圖3 ELISA法檢測各組TGF-β1、MMP-9的表達

2.4 IGF-1致肺泡上皮細胞出現轉分化(EMT)現象

免疫印跡實驗結果發現：與對照組相比,IGF-1誘導A549細胞衰老72 h后,A549細胞蛋白中的N-Cadherin、α-SAM表達明顯上調，見圖4。

圖4 免疫印跡檢測各組A549細胞蛋白中的N-Cadherin、α-SAM的表達變化

2.5 細胞衰老中出現了IGF-1/ PI3K/AKT信號通路的活化

實時定量PCR結果發現：與對照組相比,IGF-1誘導A549細胞72 h后,PI3K、p-AKT的表達明顯上調，見圖5。

圖5 qRT-PCR檢測各組A549細胞中的PI3K、p-AKT的mRNA表達水平變化

3 討 論

臨床資料的流行病特點顯示，特發性肺纖維化的發病人群普遍以老年人為主,且與AECs衰老明顯相關[8]。但AECs發生衰老的原因及具體機制不明。所以本研究的創新點是發現了IGF-1信號通路的活化導致AECs衰老后發生IPF的重要原因。

AECs在慢性損傷等病理條件下具有很強的再生及修復能力,但IPF發生時AECs喪失了自身的修復功能并啟動了后續致纖維化的生物學效應[9]。細胞衰老理論認為隨著年齡的增長,細胞會發生損傷,影響了自身的修復功能,由此可見修復功能下降的AECs與細胞衰老明顯相關[10]。但細胞衰老不僅僅是年齡增加的結果,更多的是在慢性損傷等病理條件下共同作用的結果。基礎研究發現：AECs遭遇慢性損傷時,會過度釋放IGF-1,激活IGF-1/PI3K/AKT信號通路,一方面釋放炎癥因子,形成氧化應激反應；另一方面IGF-1會加速細胞生長速度,使細胞發生功能性改變,最終發生細胞衰老[11]。雖然不少學者報道了IGF-1是致纖維化進展的關鍵細胞因子,但在肺纖維化中IGF-1是否是造成AECs衰老的重要原因，以及具體機制是什么并不清楚。所以在本研究中利用 BLM小鼠模型觀察IGF-1在肺纖維化的表達情況,同時利用IGF-1對AECs進行誘導,觀察AECs衰老的現象。在本研究中發現了BLM小鼠肺組織中不僅存在IGF-1的廣泛表達,還發現IGF-1誘導AECs 72 h后,AECs發生了明顯的細胞衰老現象。這些發現均說明了IGF-1是導致AECs衰老及肺纖維化發生的重要原因。

SASP是細胞衰老后發生纖維化生物學效用的重要標志[12]。文獻報道了IGF-1/ PI3K/AKT信號通路活化后會釋放TGF-β1、MMP-9,恰巧這些細胞因子均是IPF進展的重要蛋白[13-14]。TGF-β1可促進成纖維細胞增殖活化及膠原合成,使未成熟的成纖維細胞演變成肌成纖維細胞[15]。MMP-9則可以活化炎癥信號通路，促進炎癥細胞在肺間質中的積聚[16]。本研究IGF-1誘導小鼠AECs衰老后,除了引起細胞培養基中 TGF-β1、MMP-9表達增加外,AECs還發生了EMT現象。這更加充分說明了IGF-1致AECs衰老后發生的EMT現象是肺纖維化進展的關鍵機制。

PI3K/AKT信號通路活化依賴于上游細胞因子IGF-1的釋放[17]。PI3K/AKT信號通路的活化不僅僅是纖維化發生的重要信號通路,也是細胞衰老的重要信號通路[18]。所以本研究進一步利用IGF-1建立AECs衰老模型,檢測下游信號通路關鍵蛋白PI3K、AKT的表達,結果發現IGF-1誘導AECs衰老72 h后,PI3K、AKT的表達明顯上調。

IPF是多個蛋白介導的多條信號通路網絡樣活化過程,在AECs衰老中是否存在其他信號通路的活化及IGF-1信號通路的活化是否比其他信號通路活化更為重要,均需要進一步研究。本研究的發現有助于了解及預防衰老相關性疾病,為精準研發IPF藥物提供了臨床轉化的理論基礎。