兩個(gè)大白菜株高相關(guān)分子標(biāo)記在不同群體中的分布檢驗(yàn)

馬關(guān)鵬,周麟筆,2,趙大芹,3*,楊 巍,劉 煉,趙夏云,瞿 飛,王 堃

（1.貴州省園藝研究所，貴州貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)科院山茂園藝工程技術(shù)有限公司，貴州貴陽550006；3.貴州省園藝工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550006）

大白菜是起源于我國的大宗型蔬菜，在全國均有較大面積的種植［1-3］。大白菜的株高是重要的農(nóng)藝性狀，關(guān)系到大白菜的株型、產(chǎn)量等性狀，前人研究表明，株高同時(shí)受到環(huán)境和基因的影響［4］。分子標(biāo)記作為一種可以有效提高選育品種的手段，受到較多育種人員的青睞。開發(fā)適合的分子標(biāo)記對(duì)品種選育有事半功倍的效果。分子標(biāo)記有AFPL 標(biāo)記、RAPD 標(biāo)記、SSR 標(biāo)記、InDel 標(biāo)記等。前人已有利用不同的標(biāo)記進(jìn)行性狀與標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)開發(fā)［5-6］。高穎等［4］利用SSR 標(biāo)記通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與大白菜抽薹開花時(shí)間相關(guān)的標(biāo)記13 個(gè)，同時(shí)翟文等［5］也發(fā)現(xiàn)與植株葉片形態(tài)、植株形態(tài)等相關(guān)的標(biāo)記76 個(gè)。雖然在白菜類蔬菜已有功能標(biāo)記的開發(fā)，但是受限于群體，標(biāo)記的通用性不強(qiáng)，實(shí)際運(yùn)用不夠廣泛。利用高密度的SNP構(gòu)建遺傳圖譜雖然可達(dá)到較高密度的遺傳圖譜，從而進(jìn)行QTL 定位開發(fā)分子標(biāo)記，但是成本較高，開發(fā)較少，大多數(shù)集中在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，因此開發(fā)的標(biāo)記不一定能被使用。

貴州省園藝研究所大白菜課題組搜集鑒選了大量矮化的大白菜種質(zhì)資源，其中現(xiàn)有較矮化的資源105份，進(jìn)行分離純化后的資源53 份，使用BC1 不育系進(jìn)行回交選育的雄性不育系11份，通過小孢子培養(yǎng)獲得的DH 系8份，并且構(gòu)建了誘變純化60 份材料。且前期構(gòu)建的高密度遺傳圖譜進(jìn)行了株高QTL 的定位，開發(fā)了2 個(gè)株高相關(guān)的InDel 標(biāo)記，為鑒定其在不同的群體中的情況，使用多個(gè)群體進(jìn)行鑒定研究（其中使用的群體包括85 份F2群體、搜集鑒選的105 份、純化材料53 份群體，誘變材料純化60份群體。），以期為提高大白菜的育種效率，降低品種選育的工作量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

試驗(yàn)材料包括由貴州省園藝研究所大白菜課題組搜集的105份材料（未能完全純化）、純化的自交系53 份、經(jīng)過輻射誘變純化自交的材料60 份。自購建的（親本為Gh-4，LL-3）F2代群體85份（表1）。

表1 供試大白菜材料信息

自交系材料經(jīng)催芽后，低溫春化5 d，于2021年6月使用花盆種植于人工氣候室，前20 d 保持8℃，后期23℃，長日照條件（12 h 光照，8 黑暗）；自交系、搜集資源及誘變資源材料于2020年10月播種育苗，11月定植于蔬菜試驗(yàn)地，定植株距18 cm，行距25 cm。F2代材料分別為株高較高材料Gh-4、株高交矮材料LL-3，以Gh-4 為母本，于2019年進(jìn)行人工雜交后獲得F1代種質(zhì)，自交后獲得F2代種子，2020年播種于育苗盤后選擇85 株定植試驗(yàn)地，播種定植時(shí)間、株行距和其他材料相同。

試劑：EDTA、NaCl、CTAB、異戊醇、Tris、乙醇購買自索萊寶公司；RNase、瓊脂糖購買自上海生工公司；PCR 反應(yīng)試劑購買自南京諾唯贊生物科技有限公司的Taq DNA Polymerase 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

儀器：超微量紫外分光光度計(jì)，德國Implen。

1.2 株高性狀調(diào)查及InDel 引物來源

參考大白菜DUS 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大白菜株高展開測(cè)量，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為從植株播種開始后的第65 天后，調(diào)查統(tǒng)計(jì)株高性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。采用的2 對(duì)引物均來自于課題組大白菜基因重測(cè)序、進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建及株高QTL開發(fā)得到的InDel標(biāo)記，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表2 大白菜株高標(biāo)記引物

1.3 NDA提取及PCR擴(kuò)增

采用CTAB 法提取DNA；DNA 提取后使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。體系如下：ddH2O 13 μL，10 × Taq Buffer（Mg2+plus）2 μL，dNTP Mix（10 mM each）1 μL，Primer1（10 μM）1μL，Primer2（10 μM）1μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）1 μL；反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，72℃徹底延伸5 min。采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像儀進(jìn)行觀察分析，觀察條帶的有無，有條帶記為1，無則記為0。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為簡單鑒定分子標(biāo)記是否可以反應(yīng)株高情況，就PCR 電泳后各份材料的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并統(tǒng)計(jì)材料的株高，使用Microsoft Excel，SPSS19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高性狀的變異

從圖1可知，105群體和53自交系的株高分布較為集中，60 誘變系和F2群體的株高分布較寬。表明F2群體、60誘變系的變異較大，群體間株高的差異較大，自交系群體間的差異較小，株高分布相對(duì)集中。

圖1 不同群體的株高分布

從表3 可知，在不同群體中，植株株高的差異不一致，由于前期搜集資源時(shí)選擇的105份資源屬于相對(duì)較矮的種質(zhì)，自交系也是在相關(guān)矮化的種質(zhì)里面鑒選出來進(jìn)行自交純化的，因此105 群體和53 自交系的變異系數(shù)較小，分別為25.24 和22.94，且群體的極差差值也較小。研究的分子標(biāo)記是根據(jù)F2群體構(gòu)建后的相關(guān)數(shù)據(jù)開發(fā)鑒選的，在選擇親本時(shí)是屬于株高差異較大的組合，因此后代中株高差異較大，變異系數(shù)較大，為32.74；誘變純化的60 份材料經(jīng)過栽培驗(yàn)證，可能是輻射對(duì)植株的遺傳物質(zhì)起到了一定的改變，因此在株高的變異范圍也較大，變異系數(shù)為31.63，變異系數(shù)相較于105 群體及53 自交系群體較大，但是變異程度小于F2群體。

表3 大白菜不同群體的株高性狀統(tǒng)計(jì)

2.2 分子標(biāo)記與株高的關(guān)系

通過統(tǒng)計(jì)分析（表4）發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)進(jìn)行分子標(biāo)記的4個(gè)群體中，每個(gè)群體個(gè)體均出現(xiàn)無條帶情況。統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)分類表明，在105 群體中，引物1 和引物2 在大部分植株中均未出現(xiàn)標(biāo)記條帶，只在少數(shù)個(gè)體中出現(xiàn)條帶。歸類統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均值顯示，具有條帶的個(gè)體平均株高偏矮，但是差異很小，沒有明顯差異。在53群體及60 群體中，平均株高與條帶的有無沒有顯見的趨勢(shì)關(guān)系，群體株高之間的平均差異小。在F2群體中，引物1出現(xiàn)條帶的個(gè)體平均值比沒有出現(xiàn)的高4.51 cm，引物2 出現(xiàn)條帶的個(gè)體平均值比沒有出現(xiàn)的高3.6 cm，有較為相近的差異；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，如果把2 對(duì)引物合計(jì)在一起計(jì)算，2 對(duì)引物都出現(xiàn)條帶的植株平均株高比沒有出現(xiàn)條帶的植株高32.39%（8.23 cm），出現(xiàn)一條帶的植株平均株高比未出現(xiàn)條帶的植株高29.59%（7.52 cm）。說明可以使用開發(fā)的2 個(gè)株高相關(guān)的InDel標(biāo)記進(jìn)行一定范圍的篩選工作。

表4 不同引物在不同群體株高中的標(biāo)記顯示情況

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛用于種質(zhì)遺傳資源多樣性等方面的研究［7-8］。但是受限于種質(zhì)資源、開發(fā)成本等條件，廣泛用于性狀的標(biāo)記較少［9-10］。大多數(shù)標(biāo)記開發(fā)成本高、復(fù)雜程度高、使用計(jì)算統(tǒng)計(jì)復(fù)雜阻礙了分子標(biāo)記的實(shí)際應(yīng)用，因此在育種過程中能使用的分子標(biāo)記較少。研究利用前期開發(fā)的2 個(gè)分子標(biāo)記在不同群體中進(jìn)行簡單統(tǒng)計(jì)分析，目的在于探究鑒定較簡單的統(tǒng)計(jì)方法分析分子標(biāo)記是否可以反應(yīng)標(biāo)記所代表的性狀。

研究表明，在105、53、60 群體中的InDel標(biāo)記和株高關(guān)系不明確，分子標(biāo)記不具鑒定作用；在以Gh-4 為父本的F2群體中，具有雙標(biāo)記的植株高比不具有雙標(biāo)記的植株高32.39%（8.23 cm）。開發(fā)的2 個(gè)InDel 分子標(biāo)記可在具有Gh-4 為親本的群體中進(jìn)行株高的檢驗(yàn)。

由于開發(fā)的2 個(gè)InDel 分子標(biāo)記是利用F2群體中的一個(gè)親本進(jìn)行的，因此在F2的群體中可以簡單的按照分子標(biāo)記的有無大致把植株的高矮分成2 個(gè)群體，從其中具有2 個(gè)標(biāo)記的群體中鑒選出具有較高株高性狀的植株概率較大，可最大限度的降低投入，提高效率。但在鑒選的過程中也注意到，性狀的表現(xiàn)和環(huán)境的影響較大，不表示具有雙分子標(biāo)記的植株一定高于沒有標(biāo)記的植株。且選育品種的過程是多性狀的綜合考量，單獨(dú)看一個(gè)性狀可能導(dǎo)致其余性狀較差，需要較大的群體數(shù)量保證除去目標(biāo)性狀外的其他性狀有足夠的變異空間，否則過分依賴于分析標(biāo)記可能導(dǎo)致選育不到需要的性狀。因此，分子標(biāo)記的開發(fā)只能減少部分育種工作量，不能代替田間的鑒定。