損傷程度對甘薯黑斑病侵染特性的影響

龐林江,陸國權,李 云,李曉慧,成紀予,路興花

（1.浙江農林大學食品與健康學院，浙江杭州311300；2.貴州省生物技術研究所，貴州貴陽550006；3.貴州省園藝研究所,貴州貴陽550006）

甘薯富含維生素、鉀、鐵、鈣、膳食纖維等營養物質［1］，具有保健功效和較強的抗氧化特性，是人們喜愛的食物之一。但若貯藏方式不當或貯藏環境不適宜，易受到病原菌侵染，導致甘薯發生腐爛變質，造成巨大經濟損失［2］。甘薯黑斑病是影響甘薯生產的主要病害之一，在甘薯的栽培和貯藏期間均會發生，對薯苗與薯塊均有危害。我國每年由該病害導致的甘薯產量損失達5%～10%，嚴重時甚至高達20%～50%［3］。黑斑病會造成甘薯表皮形成黑色斑塊，味苦，有毒。被牛、豬、犬等家畜誤食，會引發氣喘、中毒，嚴重時會導致死亡［4］。黑斑病產生的毒素主要有甘薯酮、甘薯醇、甘薯寧和4-薯醇等，這些毒素耐高溫，甘薯蒸煮烤或制酒發酵等處理，都不易破壞毒素［5］。目前學者關注較多的是甘薯黑斑病的防治方向［6］，對其傳播特性的研究鮮有報道。已有研究表明煙薯25對黑斑病具有高抗性［7］，但心香品種具有高感性。以心香、煙薯25 為試驗材料，研究兩個甘薯品種在黑斑病菌侵染后病斑的生長情況和侵染特性，以期為甘薯生產和貯藏過程中的黑斑病防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

甘薯品種：心香和煙薯25，于2019年7月采集自浙江杭州甘薯試驗場。黑斑病病菌：由江蘇省徐淮地區徐州農業科學研究所提供，需置于4℃冰箱保存。

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）為生化試劑，購于青島高科園海博生物技術有限公司。

儀器設備：SW-CJ-1CU 潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司），LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），DRP-9162 型電熱恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司），智能低溫冷藏箱（寧波普朗特儀器有限公司），XSZ-H 生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 將4℃保存的黑斑病菌置于28℃恒溫培養箱復溫24 h，然后在無菌環境中轉接到新的PDA 平板上，用封口膜封口，置于28℃培養基恒溫培養7 d［8］，備用。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 參照張婕等［9］的方法在黑斑病菌培養7 d 后向PDA 平板中加入少量無菌水，并用無菌接種環輕刮后，采用4 層擦鏡紙過濾，并用血球計數板計數，無菌水稀釋，配制成1×106CFU/mL 的孢子懸浮液，備用。

1.2.3 接種 分別挑選顏色大小一致、無損傷、無病蟲害的心香和煙薯25 兩個品種的甘薯，用自來水洗凈，自然晾干。用75%的乙醇溶液擦拭［10］，放入無菌操作臺。將每個品種甘薯分為3組，分別做無損傷、表皮損傷、薯肉損傷處理，心香無損傷、表皮損傷、薯肉損傷處理分別為A0、A1、A2，煙薯25 無損傷、表皮損傷、薯肉損傷處理分別為B0、B1、B2。兩個品種的無損傷處理均在甘薯中間部位等距離處畫2 個直徑5mm 的圓。表皮損傷處理均在甘薯中間部位等距離處取2 個直徑5mm 的圓，并剝去其表皮。薯肉損傷處理均用滅菌打孔器在甘薯中間部位等距離處取2 個直徑為5 mm，深度為5 mm 的圓柱孔［11］。用一次性注射器取25 μL 的黑斑病菌孢子懸浮液涂抹于圓內或注入孔洞，晾干，置于溫度為28℃、相對濕度為90%的環境中貯藏。每隔3 d測定相關指標。

1.3 考察指標的測定

1.3.1 病斑表面直徑 在甘薯表面病斑處采用十字交叉法進行測量［12］，每個處理重復6次。

1.3.2 病斑內部直徑 將甘薯接種處橫向切開，測量病斑橫截面1/2 處的直徑，每個處理重復6次。

1.3.3 病斑深度 將甘薯接種處橫向切開，測量病斑深度，每個處理重復6次。

1.3.4 病斑面積 取橫截面的面積。計算方法：

病斑面積=病斑內部直徑×病斑深度—孔洞面積

1.3.5 腐爛指數 采用腐爛指數法［13］，依甘薯腐爛的面積劃分為0～5 級：0 級（無腐爛）、1 級（腐爛的面積≤10%）、2 級（腐爛的面積介于10%～30%）、3 級（腐爛的面積介于30%～50%）、4 級（腐爛的面積介于50%～70%）、5 級（腐爛的面積≥70%）。計算方法：

1.4 數據處理

采用origin 2018軟件對試驗數據進行作圖，并用SPSS 22.0 統計軟件進行Tukey 法組間顯著性分析，P＜0.05 表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 甘薯浸染黑斑病后的癥狀

從圖1 可知，隨貯藏時間的延長，黑斑病病斑的傳播范圍也越廣，不同損傷程度的侵染嚴重程度依次為薯肉損傷＞表皮損傷＞無損傷。經15 d 貯藏后，A0和B0處理均無黑斑產生，A1和B1處理的病變程度相近，A2病變程度明顯比B2處理深，這與辛國勝等［7］得出的煙薯25是抗黑斑品種的結論一致。

圖1 不同損傷程度的甘薯貯藏15 d后黑斑病浸染癥狀

2.2 甘薯感染黑斑病后病斑表面直徑的變化

由圖2可知，不同損傷程度的甘薯在接種黑斑病病原菌貯藏15 d 后，不同品種的無損傷甘薯均未產生病斑，受損傷的甘薯均產生不同程度的黑斑病病斑，且薯肉損傷甘薯的黑斑病病斑的表面直徑均大于表皮損傷的甘薯，且病斑的表面直徑隨貯藏時間的增加均呈上升趨勢。在貯藏期間，B2和B1處理的表面直徑均分別高于A2和A1處理，表明病原菌會刺激煙薯25表面病斑向周圍表皮蔓延的速度。貯藏到第15 天兩個品種薯肉損傷的表面直徑大小接近，均在15 mm 以上，而表皮損傷的煙薯25 達到了21.67 mm，較相同處理的心香增加了39.46%。

圖2 不同損傷程度甘薯感染黑斑病后病斑的表面直徑

2.3 甘薯感染黑斑病后病斑內部直徑的變化

由圖3 可知，在病原菌脅迫下，受到損傷的甘薯病斑內部直徑均隨著貯藏時間的延長呈現上升趨勢，均從5 mm 增加到13 mm 以上，且貯藏6～12 d，薯肉損傷的煙薯25 的病斑生長迅速，在第12 天時比相同處理的心香高23.29%。而貯藏12～15 天是薯肉損傷的心香病斑的加速生長期，在第15 天時其內部直徑超越了煙薯25，達10.75 mm，較煙薯25增加20.93%，且顯著高于其他處理，而未損傷的甘薯未形成病斑。

圖3 不同損傷程度的甘薯黑斑病病斑的內部直徑

2.4 甘薯浸染黑斑病后病斑深度的變化

由圖4 可知，在黑斑病病原菌脅迫下，受到損傷的心香和煙薯25黑斑病病斑深度均隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。薯肉損傷的甘薯病斑深度始終高于表皮損傷的甘薯，心香品種表現尤其明顯，而未損傷的甘薯則未被病原菌侵染。貯藏前6 d，病原菌的侵染速度較為緩慢，而在7～15 d 時甘薯的病斑深度急劇增大。貯藏到第15天薯肉損傷的心香病菌侵染程度最嚴重，病斑深度較薯肉損傷的煙薯25增加48%。

圖4 不同損傷程度甘薯黑斑病的病斑深度

2.5 甘薯浸染黑斑病后病斑面積的變化

由圖5 可知，在病原菌脅迫下，受到損傷的甘薯病斑面積隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢，而未損傷的甘薯沒有被病原菌侵染。貯藏到第15 天，心香薯肉損傷處理的病斑面積急速增長，達215.75 mm2，分別比煙薯25薯肉損傷處理、心香表皮損傷處理、煙薯25表皮損傷處理顯著增加58.05%、86.17%、87.41%（P＜0.05）。薯肉損傷的甘薯病斑面積始終遠高于表皮損傷的甘薯處理，表明甘薯損傷程度越嚴重，越容易被病原菌侵染產生黑色病斑且迅速生長。相對心香品種，煙薯25 表現出較好的抗性，這與煙薯25 本身具有的抗黑斑病性質一致。

圖5 不同損傷程度甘薯黑斑病病斑面積

2.6 甘薯不同損傷程度對腐爛指數的影響

由表1 可知，隨著貯藏時間的延長，未損傷的甘薯不易被黑斑病病原菌侵染，而有傷口的甘薯均會被侵染，出現腐爛現象。薯肉損傷的心香腐爛指數在貯藏期間顯著高于其他處理（P＜0.05），在貯藏第15 天時，心香薯肉損傷處理的腐爛指數高達86.67%，煙薯25 薯肉損傷處理的腐爛指數為60%，均大于50%，而表皮損傷的甘薯腐爛指數均小于30%。可見，薯肉部位損傷的甘薯更易感染黑斑病。貯藏到第15 天，心香薯肉損傷和表皮損傷處理的腐爛指數顯著高于煙薯25（P＜0.05）。

表1 不同損傷程度甘薯黑斑的腐爛指數 %

3 結論

研究表明，心香和煙薯25 品種的表皮損傷和薯肉損傷均會受到黑斑病病原菌的侵染而產生病斑，且病斑表面直徑和內部直徑均會隨著貯藏時間的延長而增長，病斑深度和病斑面積也會增加，腐爛指數不斷上漲；而無損傷的甘薯能抵抗病原菌的侵染，不會發生病變。因此，損傷是甘薯抵抗病原菌侵染的最主要因素，傷口是病原菌侵染的主要途徑，與采后蘋果青霉菌［14］的擴展入侵方式一致。研究發現，病斑在前6 天傳播速度較為緩慢，7～15 d病斑呈快速增長趨勢。

隨著貯藏時間的延長，薯肉損傷的甘薯比表皮損傷甘薯的侵染傳播速度更快，病斑深度、面積、腐爛指數遠高于表皮損傷，表明薯肉部位比表皮部位更易遭受病原菌的侵染，表皮對甘薯抵抗侵染有一定保護作用。貯藏到第15 天，兩種甘薯表皮損傷的病變程度相當，而薯肉損傷的心香除表面直徑略小于煙薯25外，內部直徑、深度、面積、腐爛指數均高于煙薯25。這是因為不同抗性品種的甘薯對黑斑病病原菌具有不同的抗性，其侵染變化特性也不同，黑斑病抗性較弱的心香品種更易受到病原菌的侵染，病斑以縱深傳播為主，且傳播速度快，受到的侵染程度嚴重。黑斑病抗性品種煙薯25的黑斑病病斑以表面橫向傳播為主，與心香品種的縱深傳播不同，這可能與甘薯內部的酶代謝等有關。