敲低PRMT5對卵巢癌細胞多西紫杉醇化療敏感性的影響及其機制

金男，楊洪艷，裴會，姜姍姍，李爍

中國醫科大學附屬盛京醫院第五產科，沈陽 110004

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，居第三位，而其病死率卻一直高居女性生殖系統惡性腫瘤首位［1-2］?；熓侵委熉殉舶┑闹匾侄?，而多西紫杉醇（DTX）是其一線化療用藥，但約20%患者在治療6個月內出現化療耐藥。因此，化療耐藥成為卵巢癌復發和化療失敗的主要原因［3-4］。蛋白精氨酸甲基轉移酶5（PRMT5）屬于PRMT家族一員，通過自身表觀遺傳學活性及與多種腫瘤相關蛋白的相互作用，參與調節基因轉錄、RNA 加工、信號轉導等生物學過程。有研究報道，PRMT5 對細胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）抑制劑非常敏感，降低PRMT5水平能夠顯著增加黑色素瘤對CDK4/6 抑制劑的敏感性［4］。IGARASHI 等［5］研究發現，PRMT5 與 JAK1、JAK3的結合能力較強，并可通過調節STAT6活化促進STAT6 介導的基因轉錄，從而促進細胞增殖。DTX 可通過抑制微管形成而抑制細胞周期進展，而PRMT5 對DTX 的細胞周期阻滯作用是否有影響目前尚不清楚。2020 年 8 月—2021 年 6 月，本研究觀察了敲低PRMT5 對卵巢癌細胞DTX 化療敏感性的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常卵巢上皮細胞株IOSE80（以下稱IOSE80 細胞），購于美國ATCC；人卵巢癌細胞株SKOV3、ES-2、A2780（以下分別稱 SKOV3、ES-2、A2780細胞），購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。陰性對照質粒、PRMT5 siRNA-1 質粒和PRMT5 siRNA-2質粒均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。Multiskan FC酶標儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FACSCanto-Ⅱ流式細胞儀，購自美國 BD 公司；Amersham Imager 600 凝膠成像系統，購自 美 國 GE 公 司 。PrimeScript ? RT Reagent Kit、SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；anti-RPMT5、anti-JAK1、anti-JAK3、anti-STAT6、anti-p-JAK1、anti-p-JAK3、anti-p-STAT6、anti-β-actin 及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或鼠IgG二抗，購自美國CST公司；Ki67 一抗、Alexa Fluor 555 二抗和 Hoechst 染料，購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞傳代培養 將 IOSE80、SKOV3、ES-2、A2780 細胞接種于含 10% FBS 的 DMEM 培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。當細胞生長融合80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化后按1∶4 傳代。取傳4 代、對數生長期、生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.3 卵巢癌細胞篩選 ①PRMT5 mRNA 表達檢測 。 取 IOSE80、SKOV3、ES-2、A2780 細 胞 ，采 用TRIzol法提取細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按PrimeScript?RT Reagent Kit 說明，將總 RNA 反轉錄為 cDNA。反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以 cDNA 為模板，按照 SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ說明進行 PCR 擴增。引物序列：PRMT5上游引物5'-CGCAGCCTCAGAGCGACGAC-3'，下 游 引 物 5'-GCGCCGTAAATGAAGGGTC-3'；U6 上游引物 5'-AGCAGAACGTGCGACATATCATCAC-3'，下 游 引 物 5'-TGCGTCTGGCCGTTAACGTC-3'。PCR反應體系共20 μL：cDNA模板 0.8 μL，上下游引物各 1 μL，2 × SYBR Green PCR Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL；反應條件：95 ℃5 min，95 ℃ 30 s、60℃ 30 s、72 ℃ 30 s 共 42 個循環。以 U6 為內參，采用 2-ΔΔCT法計算 PRMT5 mRNA 相對表達量。實驗重復3 次，取平均值。②PRMT5 蛋白表達檢測。取 IOSE80、SKOV3、ES-2、A2780 細胞，RIPA 裂解液冰上充分裂解，4 ℃下 12 000 r/min 離心15 min、離心半徑15 cm，留取上清，經BCA法蛋白定量合格。加入適量Loading Buffer，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30μg，經SDS-PAGE分離（80 V 30 min，120 V 100 min）。采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上，然后5%BSA 室溫封閉1 h，分別加入anti-PRMT5、β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或鼠IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL化學發光，暗室內曝光、顯影。Amersham Imager 600 凝膠成像系統拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3 次，取平均值。選擇PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量最高的卵巢癌細胞進行后續實驗。

1.4 細胞分組與轉染 取傳4 代、對數生長期、生長狀態良好的卵巢癌細胞，按4×106個/孔密度接種于6 孔板，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。隨機將細胞分為空白對照組、陰性對照組、siRNA-1 組、siRNA-2 組，每組設 3 個復孔。培養24 h，陰性對照組加入Lipofectamine2000 + 陰性對照質粒轉染，siRNA-1 組加入Lipofectamine2000+PRMT5 siRNA-1 質 粒 轉 染 ，siRNA-2 組 加 入 Lipofectamine2000 + PRMT5 siRNA-2 質粒轉染，空白對照組不予轉染。轉染6 h，更換含10%FBS的DMEM培養基繼續培養48 h，收集細胞，按1.3 中的方法檢測各組PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量。

1.5 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT 法。取各組上述轉染后細胞，按8 × 103個/孔密度接種于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，每組分別加入適量DTX，使其終濃度分別為1、5、10、15、20、25 μmol/L，同時設置空白孔（僅有培養基）和對照孔（僅有細胞，未經DTX 處理），然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱繼續培養。培養48 h，每孔加入5 mg/L MTT 溶液20 μL，避光孵育4 h。吸棄上清液，加入DMSO 150 μL，置于搖床上低速振蕩5 min，使結晶物充分裂解。Multiskan FC 酶標儀于570 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（實驗孔OD570值-空白孔OD570值）/（對照孔OD570值-空白孔OD570值）× 100%，利用Graphad Prism軟件繪制細胞增殖抑制曲線。選擇siRNA-1組和siRNA-2組中細胞增殖抑制率接近50%的DTX濃度進行后續實驗。

1.6 細胞凋亡檢測 取各組上述轉染后細胞，按4×106個/孔密度接種至培養皿中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，加入適量DTX，使其終濃度達到上述要求。繼續培養48 h，胰蛋白酶消化后收集細胞，避光轉移至EP 管中，然后加入Annexin V-FITC 結合液195μL 重懸細胞，再加入Annexin V-FITC 5μL 和PI 10μL，輕輕吹打混勻。室溫避光孵育20 min，上FACSCanto-Ⅱ流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.7 細胞增殖檢測 取各組上述轉染后細胞，按1×106個/孔密度接種至6 孔板（孔內放有玻片），置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，每孔加入適量DTX，使其終濃度達到上述要求。繼續培養48 h，取出玻片，4%多聚甲醛固定10 min，再放入含0.5%Tween20的PBS孵育30 min。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加Ki67 一抗孵育1 h，Alexa Fluoro 555 二抗染色，Hoechst 復染，顯微鏡下觀察細胞增殖情況。Ki67 陽性染色呈紅色，代表增殖細胞；Hoechst 陽性染色呈藍色，代表凋亡細胞。以Ki67 陽性細胞比例代表增殖細胞所占的比例。Ki67 陽性細胞比例=Ki67 陽性細胞數/總細胞數×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.8 JAKs/STATs信號通路相關蛋白表達檢測 取各組上述轉染后細胞，按1×106個/孔密度接種至6孔板，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養48 h，收集細胞，參照1.3 中的方法檢測JAK1、JAK3、STAT6 及 p-JAK1、p-JAK3、p-STAT6 蛋白表達。

1.9 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌細胞篩選結果 SKOV3、ES-2、A2780細胞PRMT5 mRNA 和蛋白相對表達量均高于IOSE80 細胞（P均＜0.05），SKOV3、ES-2、A2780 細胞PRMT5 mRNA 和蛋白相對表達量兩兩比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表1。以SKOV3 細胞PRMT5 mRNA 和蛋白相對表達量最高，故選擇SKOV3細胞進行后續實驗。

表1 卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量比較（）

表1 卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量比較（）

注：與IOSE80細胞比較，*P＜0.05。

細胞類型IOSE80細胞SKOV3細胞ES-2細胞A2780細胞PRMT5蛋白0.13±0.05 0.88±0.04*0.87±0.03*0.85±0.04*PRMT5 mRNA 1.00±0.18 3.32±0.29*3.25±0.11*3.28±0.15*

2.2 各組PRMT5 mRNA和蛋白表達比較 siRNA-1組與siRNA-2 組PRMT5 mRNA 和蛋白相對表達量均低于空白對照組和陰性對照組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量比較（）

表2 各組PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組siRNA-1組siRNA-2組PRMT5蛋白0.88±0.07 0.87±0.05 0.13±0.04*#0.12±0.03*#PRMT5 mRNA 1.00±0.11 0.97±0.12 0.27±0.03*#0.25±0.04*#

2.3 各組細胞增殖抑制率比較 各組不同濃度DTX 干預后細胞增殖抑制率比較見表3。siRNA-1組與siRNA-2 組在10μmol/L DTX 干預時細胞增殖抑制率接近50%，故選擇10 μmol/L DTX 進行后續實驗。

表3 各組不同濃度DTX干預后細胞增殖抑制率比較（%，）

表3 各組不同濃度DTX干預后細胞增殖抑制率比較（%，）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05。

組別細胞增殖抑制率1μmol/L DTX 5.21±0.57 6.20±0.80 8.24±0.32*#9.50±0.47*#20μmol/L DTX 71.76±2.42 71.57±3.04 95.73±2.83*#96.10±1.84*#25μmol/L DTX 82.83±2.47 82.60±3.22 97.78±1.90*#98.12±1.42*#5μmol/L DTX 15.10±2.45 14.97±1.37 31.67±3.50*#32.23±3.46*#10μmol/L DTX 31.62±3.32 32.77±3.36 52.51±3.38*#54.17±2.75*#15μmol/L DTX 53.10±4.19 51.97±4.24 83.12±2.39*#83.97±1.76*#空白對照組陰性對照組siRNA-1組siRNA-2組

2.4 各組細胞凋亡率比較 空白對照組、陰性對照組、siRNA-1 組和siRNA-2 組細胞凋亡率分別為（21.54 ± 3.62）% 、（23.47 ± 3.17）% 、（45.20 ±3.14）%、（47.14 ± 4.25）%。siRNA-1 組與 siRNA-2組細胞凋亡率均高于空白對照組和陰性對照組（P均＜0.05），而 siRNA-1 組與 siRNA-2 組、空白對照組與陰性對照組細胞凋亡率比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.5 各組細胞增殖比較 10 μmol/L DTX 干預48 h，空白對照組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組 Ki67 陽性細胞比例分別為（80.72 ± 6.5）%、（81.47 ± 5.3）% 、（47.21 ± 5.6）% 、（45.30 ±4.6）%。siRNA-1 組與 siRNA-2 組 Ki67 陽性細胞比例均低于空白對照組和陰性對照組（P均＜0.05），而siRNA-1組與siRNA-2組、空白對照組與陰性對照組Ki67陽性細胞比例比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.6 各組JAK/STAT 信號通路相關蛋白表達比較 見表4。

表4 各組JAKs/STATs信號通路相關蛋白相對表達量比較（）

表4 各組JAKs/STATs信號通路相關蛋白相對表達量比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組siRNA-1組siRNA-2組p-STAT6 0.69±0.06 0.74±0.09 0.10±0.03*#0.09±0.02*#JAK1 0.78±0.05 0.72±0.07 0.69±0.06 0.73±0.08 p-JAK1 0.65±0.03 0.60±0.05 0.12±0.03*#0.10±0.02*#JAK3 0.87±0.10 0.82±0.09 0.84±0.07 0.85±0.10 p-JAK3 0.45±0.08 0.43±0.04 0.12±0.02*#0.15±0.03*#STAT6 1.24±0.14 1.30±0.15 1.26±0.15 1.19±0.12

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，由于其早期癥狀隱匿，約75%患者確診時已處于中晚期，預后較差［6］。對于初診卵巢癌患者，標準治療方案為腫瘤細胞減滅術，術后輔以化療［7］。隨著外科手術技術不斷進步及化療藥物不斷更新，在過去的幾十年里卵巢癌患者整體生存率已有所提高。有研究報道，化療耐藥不可避免，是腫瘤復發、轉移以及病死率居高不下的重要原因［8-9］。DTX 是第二代紫杉烷類半合成抗腫瘤藥，其抗腫瘤特性與紫杉醇相似，主要靶點為微管蛋白及微管系統。DTX 通過促進微管聚合并抑制微管降解，阻斷G2/M期細胞分裂，從而抑制腫瘤細胞有絲分裂和增殖。由于DTX是一種半合成紫杉烷類藥物，其溶解度和生物利用大于紫杉醇，故其抗腫瘤效果優于紫杉醇。臨床藥理研究證實，DTX 比紫杉醇具有更強的抗腫瘤活性，在鉑類或紫杉醇耐藥的卵巢癌中具有更好的治療效果。目前，DTX 已獲得美國FDA 批準用于治療乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤。然而，DTX 化療耐藥仍然不可避免，故分析其耐藥機制具有重要意義。

蛋白精氨酸甲基化是哺乳動物細胞中廣泛存在的翻譯后修飾過程，能夠調節細胞的多種生物學過程［10-11］。PRMT5 是一種Ⅱ型精氨酸甲基轉移酶，能夠催化精氨酸對稱二甲基化于多種靶標上，如組蛋白、轉錄因子、剪接因子、翻譯因子和信號調節因子等［12］。PRMT5 在胚胎干細胞中高表達，對細胞增殖和自我更新至關重要。PRMT5 在有絲分裂后組織中表達較低，但在多種腫瘤組織中表達上調［13］。有研究報道，PRMT5 在胃癌中過表達，敲低PRMT5 后可抑制胃癌細胞生長和遷移［14］。YANG 等［15］研究發現，PRMT5 是鼻咽癌患者預后不良的生物標志物，并與患者放射抵抗密切相關。BAO 等［16］研究發現，PRMT5在卵巢癌組織中表達上調，并與患者預后不良有關，而敲低PRMT5后可顯著抑制卵巢癌細胞增殖。腫瘤細胞生長依賴于PRMT5活性，其原因是PRMT5的遺傳抑制或催化抑制會阻止腫瘤細胞增殖并促進其凋亡［17］。研究顯示，獲得性PRMT5抑制劑抗性的細胞對紫杉醇的敏感性發生變化，提示PRMT5表達可能與DTX 化療耐藥有一定關系。本研究結果發現，SKOV3、ES-2、A2780細胞PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量均高于IOSE80 細胞，提示PRMT5 可能參與卵巢癌的惡性進展。本研究敲低卵巢癌細胞PRMT5表達，進一步觀察了卵巢癌細胞對DTX 化療敏感性的影響，結果發現，siRNA-1 組與siRNA-2 組細胞凋亡率均高于空白對照組和陰性對照組，Ki67陽性細胞比例均低于空白對照組和陰性對照組，而siRNA-1組與siRNA-2組、空白對照組與陰性對照組細胞凋亡率和Ki67 陽性細胞比例比較差異均無統計學意義。提示敲低PRMT5 可增加卵巢癌細胞對DTX 的化療敏感性。王哲［18］研究報道，上調PRMT5表達可促進乳腺癌細胞對阿霉素的化療耐藥，而下調PRMT5 表達則可降低乳腺癌細胞對阿霉素的化療耐藥并促進其凋亡。因此，在化療方案中加入PRMT5 抑制劑可能會提高乳腺癌患者的化療敏感性。本研究結論與王哲［18］報道有相似之處。

本研究敲低PRMT5 可顯著提高卵巢癌細胞對DTX 的化療敏感性，但其具體作用機制尚不清楚。JAK/STAT 信號通路可參與促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程。STAT3的反饋激活能夠恢復細胞增殖能力，從而引起腫瘤細胞抵抗各種靶向藥物或化療藥物。三陰性乳腺癌細胞對熱休克蛋白90 抑制劑耐受后，JAK/STAT 信號通路轉導增強，而JAK/STAT 信號通路抑制劑則可增強熱休克蛋白90抑制劑的細胞毒性。以上研究表明，JAK/STAT 信號通路傳導可能與腫瘤細胞的化療耐藥機制有關。本研究結果發現，siRNA-1 組與 siRNA-2 組 p-JAK1、p-JAK3、p-STAT6 蛋白相對表達量均低于空白對照組和陰性對照組，JAK1、JAK3、STAT6蛋白相對表達量與空白對照組和陰性對照組比較差異均無統計學意義，并且siRNA-1 組與siRNA-2 組、空白對照組與陰性對照組各蛋白相對表達量比較差異亦無統計學意義。提示敲低PRMT5 可能通過抑制JAK/STAT信號通路傳導而增強卵巢癌細胞對DTX 的化療敏感性。

綜上所述，敲低PRMT5 可增強卵巢癌細胞對DTX 的化療敏感性，其機制可能與抑制JAK/STAT信號通路傳導有關。