Piezo1/JAK2信號通路與膝骨關節炎大鼠軟骨細胞凋亡的關系

王勇，王強，邢宇慶，劉芙君，蘇日亮，馬金健

1 山東第一醫科大學附屬省立醫院推拿科，濟南 250021；2 山東中醫藥大學附屬醫院推拿科

膝骨關節炎（KOA）是臨床常見的一類骨關節疾病，是引起中老年人膝痛的最常見原因，嚴重影響人們的生活和工作。60 歲以上的人群中，有癥狀的KOA 可達 50%［1］。軟骨細胞凋亡被認為是 KOA 重要的病理機制之一。軟骨細胞凋亡的數量與KOA的嚴重程度密切相關［2］。Piezo1 通道蛋白是 2010 年被發現的［3］，是一種機械敏感性離子通道蛋白，也是一種非常重要的膜通道。細胞學研究發現，Piezo1可以介導軟骨細胞膜受到牽張力所形成的內電流，從而證實了其在軟骨細胞力學傳導中的作用［4］。KOA 患者膝關節力的傳導和分布出現異常，可使軟骨細胞受到異常的機械牽張應力，從而導致膝關節軟骨細胞的過度凋亡［5-6］。細胞學研究發現，對軟骨細胞施加不同時長的機械牽張應力，可以激活Piezo1 通道，從而介導軟骨細胞的凋亡［7-8］。但是目前并無動物實驗對此加以印證。研究發現，蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導子與激活子3（JAK2-STAT3）信號通路與軟骨細胞凋亡密切相關［9-12］，但是目前Piezo1 與JAK2 在軟骨細胞凋亡過程中的作用鮮見相關報道。2021 年1 月—7 月，我們觀察了Piezo1/JAK2 信號通路與KOA 大鼠軟骨細胞凋亡的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 清潔級成年雄性SD 大鼠50 只，體質量（120 ± 10）g，購于山東大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（魯）20110014。普通飲食飼養于山東第一醫科大學附屬省立醫院動物實驗中心，適應性喂養1 周，飼養環境溫度20~25 ℃，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。蘇木精染色試劑盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），小鼠抗大鼠Piezo1一抗、小鼠抗大鼠JAK2 一抗、小鼠抗大鼠p-JAK2 一抗、Caspase-3 抗體試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（美國領先化學公司），HRP 標記的二抗、DAB 染色試劑盒、抗地高辛抗體、蛋白電泳Marker（濟南檸檬生物技術有限公司），固綠染色液、番紅O染色液、酶標儀（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），照相顯微鏡（日本佳能公司），Image-Pro plus6.0 系統（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 動物分組與模型構建 將大鼠隨機分為假手術組（10只）和模型組（40只）。模型組采用Hulth 法建立大鼠KOA 模型［13］，手術當天大鼠禁食不禁水，將其仰臥固定于手術臺上，經腹腔注射氯胺酮（100~200 mg/kg）麻醉后剪除其右后肢膝關節內側絨毛，于髕骨內側剪開皮膚，手術切口約1 cm長，逐層尋找膝關節內側副韌帶，充分暴露內側副韌帶后將其剪斷；切開關節囊，觀察大鼠是否存在原發性膝關節病變，剔除存在膝關節病變大鼠。將整個內側半月板完整切除，采用虹膜剪將大鼠前后交叉韌帶剪斷。常規縫合手術切口，無菌包扎固定。術后肌注青霉素80 000 U，1 次/天，連續肌注3 d。傷口每日換藥1次，連續換藥7 d。術后第2 天正常飲食飲水，每天觀察大鼠傷口有無感染和動物跛行情況，并強迫驅趕動物活動30 min。假手術組充分麻醉后立即取出右后肢膝關節軟骨組織，再斷頸處死。模型組分別于術后7、30、60、90 d 各取10 只斷頸處死，分別取出右后肢膝關節軟骨組織。所有軟骨組織置于10%甲醛以及-80°C冰箱中備用。

1.3 膝關節軟骨組織病理變化觀察 采用番紅O-固綠染色法［14-15］。切除的關節軟骨組織用生理鹽水洗滌，拭干后用10%甲醛溶液固定24 h，以防抗原丟失；將軟骨組織放入混合酸脫鈣液中脫鈣24 h；常規石蠟包埋，切片（厚度5 μm）。石蠟切片65 ℃脫水4 h，用不同濃度二甲苯和乙醇自動脫蠟至水；滴加蘇木精，細胞核染色1~3 min，鏡下觀察染色深淺情況以調整染色時間；用自來水洗滌殘留的蘇木精；滴加鹽酸乙醇分化液，分化20 s，自來水洗滌；滴加0.02%固綠水溶液，使細胞外基質染色3 min，1%冰醋酸洗滌3 次，滴加0.1%番紅水溶液，3 min 后95%乙醇浸洗，無水乙醇脫水；二甲苯透明3 次，每次2 min，中性樹膠封片。用顯微鏡（×200）觀察關節軟骨的結構、色澤及各層軟骨細胞的形狀、數量、排列、壞死程度等。

1.4 膝關節軟骨細胞凋亡檢測 采用TUNEL 染色法。在烤片機將待染色切片在65 ℃烘烤2 h，常規二甲苯脫蠟劑脫蠟2 次；分別用無水乙醇、90%乙醇、85%乙醇和75%乙醇脫水，直至脫蠟水化完全，PBS 浸 泡 5 min。 滴 加 3% H2O2，10 min 后 滴 加Proteinase K 工作液，37 ℃恒溫消化10 min。每張切片滴加Labeling buffer標記的緩沖液20μL以保持其濕潤，配制工作液后甩去多余液體，然后每張切片加工作液20 μL，濕盒內37 ℃恒溫孵育2 h；滴加封閉液50μL，封閉30 min；滴加稀釋的生物素化的抗地高辛抗體（1∶100 稀釋）50 μL，濕盒37 ℃恒溫孵育2 h。滴加SABC 抗體稀釋液（1∶100 稀釋）10 μL，濕盒37 ℃恒溫孵育2 h。滴加DAB 顯色工作液（試劑A、B、C 各50 μL，溶于 1 000 μL 蒸餾水），顯色10~15 min，呈棕黃色顆粒狀時顯色完全，蘇木精復染3 s。梯度脫水透明處理后，室溫晾干后中性樹膠小心封片，注意避免留氣泡和溢膠，晾干。200 倍光學顯微鏡下觀察，用Image-Pro plus6.0 軟件分析陽性染色面積，并根據陽性染色情況判斷軟骨細胞凋亡程度。TUNEL 染色陽性區域范圍越大，軟骨細胞凋亡程度越嚴重。

1.5 膝關節軟骨細胞破壞程度評價 采用Mankin's 評分，通過膝關節軟骨組織病理變化的情況評價大鼠 KOA 模型［16］。Mankin's 評分越高，軟骨細胞破壞越嚴重。

1.6 膝關節軟骨組織中Piezo1、JAK2、p-JAK2、Caspase-3 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。將膝關節軟骨組織置冰上，用顯微剪將組織剪碎，按20 mg 組 織 加 入 200 μL 裂 解 液 和 PMSF 混 合 液（100∶1），研磨器研磨組織；組織裂解完全后，轉移至EP管中，15 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm）；吸取上清液2 μL，用蒸餾水稀釋，檢測蛋白濃度。BCA法測定蛋白濃度，緩慢加入電泳緩沖液，用70 V恒壓預電泳30 min。向側孔中加入標準Marker 蛋白，首先30 V 恒壓電泳，待樣品濃縮在濃縮膠與分離膠之間并呈一條線后，調整電壓為100 V，溴酚藍條至膠板下緣時，停止電泳。將大小適宜的PVDF膜浸泡于甲醇中10 min，按順序安裝后閉合夾子，將夾子置轉膜槽，電壓100 V，電流220 mA 進行轉膜。將轉膜的PVDF 膜在含5%脫脂牛奶的TBST 緩沖液浸泡，室溫封閉1 h，傾去封閉液，然后將PVDF 膜浸泡在稀釋好的小鼠抗大鼠Piezo1、JAK2、p-JAK2 及Caspase-3 一抗（稀釋比均為 1∶100）中，水平搖床4 ℃過夜，第2 天回收。加入HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 熒光二抗（稀釋比1∶100），室溫孵育1 h，棄去二抗加入ECL 發光液，以GAPDH 為內參照。Image J 軟件分析蛋白電泳條帶灰度值。蛋白相對表達量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內參照蛋白電泳條帶灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料用表示，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；指標間的相關性分析采用Pearson 相關法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組膝關節軟骨組織病理變化比較 假手術組軟骨正常呈紅色，軟骨下骨呈藍色。番紅O-固綠染色可見軟骨縱切片潮線，潮線上方透明軟骨，潮線下方鈣化層，鈣化層底部粘合線界限明顯。潮線與粘合線口間可見齒梳樣結構鈣化軟骨，厚度可達300μm，薄處不足10μm，結構致密，潮線附近可見少量肥大軟骨細胞。術后7~90 d，模型組膝關節關節軟骨破壞逐漸加重。術后7 d，關節軟骨變為粉紅色，出現多條潮線，鈣化層增厚；術后30 d，鈣化層進一步變寬，伴少量血管顯現；術后60~90 d，鈣化層及非鈣化層進一步退變，表現為局部有纖維樣增生潮線距離進一步增大，軟骨細胞明顯減少并集中在潮線附近。

2.2 兩組軟骨細胞凋亡情況 假手術組及術后7、30、60、90 d 模型組 TUNEL 染色陽性區域分別為（3.17 ± 0.05）% 、（10.98 ± 2.01）% 、（18.62 ±4.37）%、（25.34 ± 6.81）%、（47.55 ± 7.10）%。與假手術組比較，術后7、30、60、90 d模型組TUNEL 染色陽性區域均增大（P均＜0.05），且隨時間延長TUNEL染色陽性區域逐漸增大。

2.3 兩組軟骨破壞情況比較 假手術組及術后7、30、60、90 d 模型組 Mankin's 評分分別為（0.36 ±0.08）、（4.75 ± 0.72）、（7.67 ± 0.22）、（9.07 ±0.32）、（10.67 ± 0.22）分。與假手術組比較，術后7、30、60、90 d 模型組 Mankin's 評分均高（P均＜0.05），且隨時間延長Mankin's評分逐漸升高。

2.4 兩組膝關節軟骨組織內Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表達比較 與假手術組比較，術后7、30、60、90 d 模型組 Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表達均高（P＜0.05），且隨時間延長各蛋白表達逐漸升高。見表1。

表1 兩組膝關節軟骨組織Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表達比較（）

表1 兩組膝關節軟骨組織Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表達比較（）

注：與假手術組比較，P＜0.05。

組別假手術組模型組術后7 d術后30 d術后60 d術后90 d n 10 Piezo1 0.21±0.02 JAK2 0.23±0.02 p-JAK2 0.24±0.01 Caspase-3 0.20±0.01 0.26±0.03*0.27±0.01*0.31±0.05*0.56±0.07*10 10 10 10 0.25±0.02*0.26±0.05*0.32±0.08*0.60±0.09*0.27±0.03*0.30±0.07*0.39±0.05*0.60±0.09*0.27±0.02*0.31±0.05*0.38±0.04*0.59±0.08*

2.5 軟骨細胞凋亡情況與Mankin's 評分及Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表達的關系 Pear-son 相關分析結果顯示，關節軟骨TUNEL 染色陽性區域與 Mankin's 評分（r=0.781，P＜0.05）、Piezo1 蛋白表達（r=0.577，P＜0.05）、JAK2 蛋白表達（r=0.725，P＜0.05）、p-JAK2 蛋白表達（r=0.798，P＜0.05）以及Caspase-3 蛋白表達（r=0.691，P＜0.05）存在正相關關系。

3 討論

KOA 是臨床最常見的一種無菌性炎癥性骨關節病，是由多種因素導致的一種以軟骨破壞、軟骨下骨骨化或囊性變、滑膜炎癥、關節囊攣縮、肌無力等為特征的慢性疾病。目前，大多數研究者認為，生物力學因素在KOA 的發生發展中起著至關重要的作用［17］。膝關節軟骨細胞能夠感受力學的變化，通過力敏感離子通道激活相關的信號傳導通路影響軟骨細胞的分化、凋亡等，從而影響KOA 的病程發展與變化［18］。

KOA 的發生發展與軟骨細胞凋亡密切相關，是KOA 發生發展的重要病理機制之一，已經成為了目前研究的熱點。KOA 軟骨細胞凋亡的機制與信號通路的研究越來越受到重視。Piezo 離子通道屬于機械敏感性離子通道，可將細胞膜接收到的機械力學信號、電信號或化學信號，傳遞至胞內，引起一系列 生化 反應［19］，并 能 調節 細胞 體積 的穩 態［20］。Piezo1 在哺乳動物細胞中幾乎無處不在，是一種非常重要的膜通道，軟骨細胞受到細胞外界環境中的力學刺激后通過Piezo1影響其增殖、分化及凋亡［21］。軟骨細胞中Piezo1、Piezo2 高表達，在軟骨細胞中應用 siRNA 能夠抑制 Piezo1 和 Piezo2 表達，從而消除機械反應。同時，通過原子力顯微鏡/Ca2+成像平臺檢測Ca2+流入的機械響應發現，Piezo1 和Piezo2 均可導致軟骨細胞在超生理壓迫下的機械轉導［22］。因此，本研究復制了大鼠KOA 模型，圍繞不同時間節點大鼠軟骨細胞Piezo1的變化展開研究。有實驗發現，對細胞膜施以不同的牽張力可以激活Piezo1，加快膝關節軟骨細胞的凋亡［7-8］。本實驗中，我們觀察了不同時間節點大鼠膝關節軟骨細胞Piezo1 的表達，并與軟骨細胞凋亡進行相關性分析，發現二者具有正相關性，與文獻［7-8］報道一致。

JAK 蛋白包括 JAK1、JAK2、JAK3 以及 Tyk2。JAK 包含 1 個 FERM 域、1 個 SH2 相關域、1 個激酶結構域和1 個假激酶域。其中激酶域對JAK 活性至關重要，因為只有通過激酶域才能使JAK 磷酸化。JAK-STAT通路的研究主要集中在炎癥性疾病、影響免疫系統的疾病及腫瘤性疾病，關于關節軟骨凋亡的研究較少，目前主要集中在JAK2-STAT3 這個通路。通過檢索共發現4 篇文獻認為JAK2-STAT3 信號通路與軟骨細胞凋亡密切相關［9-12］。我們研究發現，隨著KOA 的進展，JAK2 蛋白表達升高，這與以上文獻［9-12］結果一致。同時我們還發現，JAK2 蛋白表達升高與軟骨細胞的凋亡密切相關，JAK2蛋白表達越高，軟骨細胞凋亡越嚴重。Caspase途徑是細胞凋亡的主要途徑［23］，Caspase-3 在細胞凋亡中起至關重要的作用，是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，被稱為“死亡蛋白酶”，主要在凋亡的執行階段發揮重要作用，損傷DNA，導致其復制、轉錄及修復受到嚴重損害［24-25］。陳喜德等［26］用大鼠制作 KOA 模型，采集不同時間段模型鼠的軟骨組織，并檢測Caspase-3蛋白的表達，結果發現，Caspase-3與軟骨細胞凋亡程度呈正比。本研究結果與文獻［26］報道一致。

本研究構建了KOA 大鼠模型，隨著時間延長，模型大鼠膝關節軟骨TUNEL 染色的陽性區域也隨之增加，Mankin's評分逐漸升高，提示大鼠膝關節的病理性破壞程度逐漸加重，KOA 逐漸進展。本研究發現，隨著骨關節病變的進展，KOA 大鼠膝關節軟骨內Piezo1蛋白表達也隨之升高，并伴有JAK2的激活。Pearson相關性分析顯示，關節軟骨TUNEL染色的陽性區域與 Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表達存在明顯的正相關關系。說明Piezo1/JAK2信號通路可能參與了KOA 膝關節軟骨細胞的凋亡過程。

在研究過程中，因考慮雌性大鼠性別或體內激素水平可能對本實驗造成的影響，本實驗未選用雌性大鼠。同時，因實驗條件受限，樣本量較少；也未能對JAK2 的下游信號STAT3 做進一步研究，這將是我們未來研究的方向。