多表位融合蛋白對動物布魯氏菌病的診斷價值

徐琳琳，白瓊瓊，張金鵬，焦陽，殷德輝

徐州醫科大學公共衛生學院環境與健康重點實驗室，江蘇徐州 221004

近年來，人獸共患傳染病呈現全球蔓延的趨勢，如布魯氏菌病，不僅對人類健康造成巨大威脅，也給世界各國經濟帶來巨大損失［1］。布魯氏菌感染雌性動物后，會造成動物流產；且人群對布魯氏菌普遍易感，人類通過直接接觸感染布魯氏菌的羊、牛、豬等牲畜及其分泌物或排泄物以及進食被布魯氏菌污染的食品等感染［2］。由于人類布魯氏菌病的臨床表現多樣，缺乏特異度，因此診斷十分困難，易被誤診為登革熱、瘧疾、病毒性出血疾病等［3-5］。因而改進現有的診斷方法，選擇合適的診斷抗原十分必要。2015 年 8 月—2018 年 10 月，本研究利用生物信息學相關技術設計一種新的布魯氏菌多表位融合蛋白（rMEP），并利用該蛋白構建間接酶聯免疫吸附試驗（iELISA），以實現對牛、羊等家畜血清的檢測，旨在探索一種新的布魯氏菌病血清學診斷方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 93份羊血清、74份牛血清，經試管凝集試驗（SAT）和玫瑰紅平板凝集試驗（RBPT）確認為布魯氏菌病陽性樣本；66份羊血清、79份牛血清樣本，經SAT 和RBPT 確認為布魯氏菌病陰性樣本。牛、羊血清樣本由中國動物衛生與流行病學中心（青島）提供。大腸桿菌BL21［DE3，生工生物工程（上海）股份有限公司］，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，美國Sigma 公司），PBS 緩沖液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，96孔板（美國Corning公司），卵清蛋白（TCI，日本東京化成工業株式會社），HRP-重組蛋白G（美國Thermo 公司），SDS-PAGE 試劑盒（碧云天生物技術有限公司），EL-TMB 顯色試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，脂多糖（LPS，中國動物衛生與流行病學中心），HRP 標記的山羊抗兔IgG（美國Bioworld 公司），兔血清（天津生物芯片技術有限責任公司）；酶標儀（BioTek，美國伯騰儀器有限公司），恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），電泳儀（Bio-Rad，美國伯樂公司）。

1.2 外膜蛋白選擇 根據文獻［6-8］選擇4 個布魯氏菌外膜蛋白（OMP），即 OMP16、OMP31、OMP2b、BP26為目標蛋白，在美國國家生物技術信息中心網站 https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/下載所選蛋白的氨基酸序列，使用蛋白質序列搜索算法工具（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）進行氨基酸序列比對，根據比對結果選擇布魯氏菌中的保守氨基酸序列。

1.3 OMP 表位預測 利用 ABCpred（http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/）［9］、Bepipred（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred/0）［10］和 COBEpro（http：//scratch.proteomics.ics.uci. edu/）［11］三種表位預測工具，預測線性B細胞表位，并選擇三種預測工具重疊的B 細胞表位作為候選表位，利用IEDB（http：//tools.iedb.org/main/tcell/）表位預測工具預測T細胞表位。

1.4 rMEP 制備 采用原核表達系統制備rMEP，用linke‘rGGGS’串聯候選B、T 細胞表位，以免形成鉸鏈區。根據得到的氨基酸序列推斷出密碼子，并利用優化網站（http：//www.jcat.de/）對原核表達系統進行密碼子優化。優化后的序列由生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因合成，同時加入6 ×His 標簽，以便隨后進行純化和鑒定。將合成的基因片段與表達載體pGEM-T 連接，并將其轉入大腸桿菌 BL21（DE3）中進行培養，當 OD600值達到 0.6時，用0.5 mmol的IPTG 誘導表達，并在37 ℃下培養4 h。12 000 r/min 離心1 min，離心半徑 9.5 cm，收集細菌，用超聲破碎后SDS-PAGE 分離，出現目的條帶，即確定rMEP表達。

1.5 rMEP純化 采用鎳瓊脂糖親和色譜法。用超聲破碎菌體：將收集的細菌菌體用破碎buffer溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率400 W，20 min（超聲2 s、暫停6 s為1個循環）。超聲完畢，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，離心半徑9.5 cm，棄上清液。沉淀用包涵體溶解Buffer進行溶解，冰浴中用超聲破碎，功率400 W，20 min（2 s、暫停6 s 為1 個循環）。超聲完畢，4 ℃下12 000 r/min 離心20 min，離心半徑9.5 cm，上清做下一步純化。鎳瓊脂糖親和層析：取5 mL Ni-NTA，用10 倍柱床體積的Binding buffer 清洗平衡柱子，流速5 mL/min；上柱，流速為2 mL/min，收集穿透液；10 倍柱床體積的Binding buffer 清洗，流速10 mL/min；Wash buffer 洗雜，流速 5 mL/min，收集洗脫液；Elution buffer 洗脫，流速 2 mL/min，收集洗脫液。各洗脫組分經SDS-PAGE 分離后，將純度較好的洗脫組分透析到buffer 中，4 ℃過夜后進行陰離子交換層析。陰離子交換層析：取10 mL Q Sefinose FF填料，用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5 mL/min；樣品上柱，流速為3 mL/min，收集穿透液；5 倍柱床體積的Wash buffer 清洗柱子，流速 2 mL/min；Elution buffer 洗脫，流速 2 mL/min，收集洗脫液。各洗脫組分經SDS-PAGE 分離后，將高純度組分透析到buffer中，4 ℃透析過夜，0.45μm濾膜過濾分裝，-80 ℃保存。

1.6 牛、羊血清中抗布魯氏菌抗體檢測 采用iELISA。純化的rMEP 用PBS 緩沖液稀釋至濃度10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃過夜。PBST 洗滌4次，然后每孔加入1%卵清蛋白封閉液300 μL，37 ℃孵育1.5 h，PBST再次洗滌4次，羊和牛血清用PBS稀釋（1∶400）后，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌4 次，加入1∶5 000 稀釋的HRP-重組蛋白G（PBST 稀釋），在室溫下孵育25 min。PBST洗滌4次，根據EL-TMB顯色試劑盒說明書進行顯色，每孔加入顯色溶液100 μL，室溫下將酶標板置于黑暗處，顯色5~15 min，加入終止液50μL。酶標儀檢測OD450值，所有樣品設有復孔。

1.7 rMEP在布魯氏菌病診斷中的特異性檢測 采用特異性試驗。為了驗證rMEP 在布魯氏菌病診斷中的特異性，使用已建立的iELISA 來檢測其他常見病原菌免疫的兔子血清（耶爾森菌O9、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和沙門氏菌），二抗使用HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶20 000稀釋），其他步驟按1.6中iELISA，計算陽性血清OD450值（P）與陰性血清OD450值（N）的比值。P/N＞2.1判定為陽性。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism6.05 軟件，繪制受試者工作特征（ROC）曲線，用曲線下面積評價rMEP 的診斷效能，利用約登指數計算cut-off 值，同時分析在cut-off值下的靈敏度和特異度。

2 結果

2.1 rMEP制備和純化結果 預測并選擇了25個重疊的表位作為候選表位，將選擇的表位使用linke‘rGGGS’串聯后，共獲得532 個氨基酸。根據構建的rMEP 氨基酸序列，對原核表達系統進行了密碼子優化，然后連接到表達載體pET-28b上，轉化到BL21（DE3）細胞中進行IPTG誘導表達、純化。制備的rMEP相對分子質量約為6×104，純化后濃度為1.39 mg/mL。

2.2 rMEP 的診斷效能 用iELISA 測試了159份羊血清樣本，用rMEP 作為診斷抗原時，ROC 曲線下面積 為 0.998（95%CI：0.993~1.002），cut-off 值 為0.595 5，診斷靈敏度為96.97%（95%CI：0.894 8~0.996 3）、特異度為98.92%（95%CI：0.941 5~0.999 7）。在此cut-off值下，93 份陽性樣本中有92 份診斷為陽性，陽性診斷符合率為98.92%；66 份陰性樣本中有64 份診斷為陰性，陰性診斷符合率為96.97%。用LPS 作為診斷的對照抗原時，ROC 曲線下面積為0.995（95%CI：0.987~1.002），cut-off 值為 0.716 5，診斷靈敏度為100%（95%CI：0.945 6~1.000 0）、特異度為 95.7%（95%CI：0.893 5~0.988 2）。在此cut-off值下，只有4例陰性樣本被誤診為陽性。見表1。

用 rMEP 檢測了 153 份牛血清樣本，用 rMEP 作為診斷抗原時，ROC 曲線下面積為 0.997（95%CI：0.994～1.001），cut-off 值為0.772 5，診斷靈敏度為98.65%（95%CI：0.927 0～0.999 7）、特異度為96.20%（95%CI：0.893 0～0.992 1）。在此 cut-off值下，74 份陽性樣本中有73 份診斷為陽性，陽性診斷符合率為98.65%；79 份陰性樣本中76 份診斷為陰性，陰性診斷符合率為96.20%。用LPS作為診斷的對照抗原時，ROC 曲線下面積為 0.987（95%CI：0.973~1.001），cut-off 值為 0.969 5，診斷靈敏度為95.65%（95%CI：0.878 2~0.990 9）、特 異 度 為97.47%（95%CI：0.911 5~0.996 9）。在此 cut-off 值下，有3 例陽性樣本被誤診為陰性，2 例陰性樣本被誤診為陽性。見表1。

表1 rMEP診斷的陽性預測值、陰性預測值

2.3 rMEP 在布魯氏菌病診斷中的特異度 rMEP作為抗原與所選血清無交叉反應，見表2。

表2 rMEP作為抗原診斷的特異性

3 討論

在布魯氏菌病流行地區，建立快速準確的診斷方法是預防和控制該疾病的前提條件。血清學抗體檢測常被用來診斷動物的布魯氏菌病［12］。由于B 細胞表位是抗體識別的分子位點［13］，隨著生物信息學技術的發展，已經有多種細胞表位在線預測工具。本研究使用生物信息學工具對主要布魯氏菌OMP的優勢抗原表位進行了預測。然而，使用單一的生物信息學工具預測免疫原性B細胞表位的成功率很低。因此，本研究中使用了三種不同的B 細胞預測工具（ABCpred、Bepipred 和 COBEpro）和 T 細胞表位預測工具。布魯氏菌的各種OMP 具有高度的免疫活性，可用于疾病的血清學診斷。而當前常用的LPS抗原，存在交叉反應問題［14］，OMP 有作為候選診斷抗原的潛力。同時，隨著原核蛋白表達技術的發展，蛋白制備對實驗室安全級別要求相對較低，而LPS制備則需要培養布魯氏菌進行提取，對實驗室的要求相對較高［15］。當前，疫苗的許多研究將熱點集中在了布魯氏菌的OMP 抗原上。這些研究表明，使用布魯氏菌的OMP 免疫動物后，可以產生較強的免疫保護反應［16-20］。我們前期的研究結果也表明，這種融合蛋白可以在小鼠體內產生較強的Th1、Th2型免疫反應［21］。

在前期研究的基礎上，將rMEP 作為診斷抗原建立了牛羊布魯氏菌病iELISA 診斷方法。利用新建的診斷方法對159 份羊血清樣本進行評估，結果顯示其陽性和陰性診斷符合率分別為98.92%、96.97%；對153 份牛血清樣本進行評估，結果顯示其陽性和陰性診斷符合率分別為98.65%、96.20%。這表明rMEP 作為一種蛋白抗原在診斷牛羊布魯氏菌病中準確率很高。本研究結果還表明，rMEP在區分布魯氏菌患病動物和健康動物方面與LPS幾乎不相上下，rMEP與一些常見的食源性病原體如沙門氏菌及大腸桿菌O157：H7 等也不存在交叉反應，表明該診斷方法具有較高的靈敏度和特異度，即布魯氏菌OMP 結合生物信息學技術和iELISA 技術在疾病血清學診斷中應用價值較高，具有將理論研究應用于生產實踐中布魯氏菌病血清學檢測的潛力。

總之，本研究用新設計的rMEP 建立了檢測牛、羊布魯氏菌病的iELISA方法。利用大腸桿菌表達系統過量表達了由布魯氏菌4個主要OMP優勢抗原表位組成的重組蛋白，滿足了在短時間內生產大量診斷性抗原的需要，不僅節省了時間，而且避免了LPS抗原的制備，使診斷過程更加安全方便，為疾病的感染提供了一種安全簡便的診斷方法。此外，這種基于rMEP 的布魯氏菌病診斷方法可以為其他傳染病的診斷提供新的思路。然而，我們建立的診斷方法尚不能區分動物所感染的布魯氏菌類型以及區分接種疫苗、未接種疫苗的動物，這些還需深入研究。