拉巴 張蒙蒙 王明桂 賀建清

【Fundprogram】 The National Natural Science Foundation of China Grants (81870015)

早期準(zhǔn)確診斷和治療結(jié)核病是“終止結(jié)核病戰(zhàn)略”的重要措施[1-2]。目前，診斷結(jié)核病主要依賴于抗酸桿菌涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測以及組織病理等病原學(xué)檢查，但即使結(jié)合了多種檢測手段，全球肺結(jié)核的確診率仍不足60%[1]，在低收入及資源有限的地區(qū)甚至更低。這就意味著結(jié)核抗體、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)以及γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assays，IGRA)等在內(nèi)的免疫學(xué)檢測可能在臨床診斷中發(fā)揮重要作用[1, 3-5]。尤其是近幾年發(fā)現(xiàn)，IGRA檢測試劑盒可以克服結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)的一些假陽性率及測量誤差等局限性[6]，已被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的早期輔助診斷和監(jiān)測中[1, 3-5]，但該方法的診斷價(jià)值在機(jī)體免疫功能受到抑制時(shí)可能會(huì)受到影響。

營養(yǎng)不良是結(jié)核病的危險(xiǎn)因素，而結(jié)核病作為一種消耗性疾病，又會(huì)加重營養(yǎng)不良[7-8]。研究顯示，IGRA檢測結(jié)果的不確定性和低水平的IFN-γ濃度均與營養(yǎng)不良相關(guān)[9]。有學(xué)者在低體質(zhì)量指數(shù)(BMI)的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)中發(fā)現(xiàn)多種重要趨化因子水平降低[10]，但目前尚無探討營養(yǎng)不良對(duì)IGRA檢測結(jié)核病結(jié)果影響的報(bào)道。因此，筆者擬通過對(duì)不同營養(yǎng)狀態(tài)結(jié)核病患者的IGRA檢測結(jié)果進(jìn)行分析，以評(píng)價(jià)營養(yǎng)狀態(tài)是否會(huì)影響結(jié)核病患者的IGRA檢測結(jié)果。

資料和方法

1.研究對(duì)象：采用回顧性研究的方法，納入2015年1月至2018年11月于四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科符合入組標(biāo)準(zhǔn)的443例住院結(jié)核病患者作為研究對(duì)象，收集患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、吸煙史、飲酒史、病原學(xué)檢測結(jié)果(包括抗酸桿菌涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、病理學(xué)檢測、結(jié)核DNA檢測)、IGRA、外周血淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群等臨床資料。

按照BMI數(shù)值，將患者分為營養(yǎng)不良組(BMI<18.5)和非營養(yǎng)不良組(BMI≥18.5)。其中，營養(yǎng)不良組136例，包括男性90例，女性46例，中位年齡為29.0(20.0,49.0)歲；非營養(yǎng)不良組307例，包括男性161例，女性146例，中位年齡為39.0(27.0，52.0)歲。 兩組患者在性別、年齡、身高、體質(zhì)量和病原學(xué)檢測任一陽性的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在其他方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見表1。

表1 結(jié)核病患者一般特征在兩組患者中的分布情況

2.入組標(biāo)準(zhǔn)：剔除臨床資料不全者后，納入結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性、病理組織檢查陽性、結(jié)核DNA檢測任一陽性者(病原學(xué)確診)；排除其他肺部疾病后納入符合結(jié)核病影像學(xué)表現(xiàn)，并至少有肺結(jié)核可疑癥狀、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)中等及以上陽性、IGRA陽性、結(jié)核抗體陽性、抗結(jié)核藥物治療有效之一者(臨床診斷病例)。

3.IGRA檢測：本研究使用QuantiFERON-TB-Gold-In-tube(QFT-GIT)檢測技術(shù)，采用TB-IGRA檢測試劑(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：TR20141207-TR20181010A)按照說明書進(jìn)行檢測。(1)標(biāo)本采集與處理：采用肝素抗凝真空采血管采集患者外周靜脈全血4～6 ml。2 h內(nèi)將全血標(biāo)本分裝到N(本底對(duì)照管)、T(測試管，即結(jié)核抗原管)、P(陽性對(duì)照管，即促有絲分裂因子管)，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，3000 r/min離心10 min(離心半徑為20 cm)后收集上清液，檢測上清液中IFN-γ含量。(2)結(jié)果判定：本底對(duì)照管及陽性對(duì)照管用于判斷檢測的有效性；以校準(zhǔn)品的抗原含量(12.5～400 pg/ml)及其對(duì)應(yīng)的吸光度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程，P管含量值為陽性對(duì)照值，IGRA絕對(duì)值為T管含量值與N管含量值的差值(T-N)，當(dāng)T-N≥14.0且≥N/4則判定為檢測結(jié)果陽性。

4.外周血淋巴細(xì)胞檢測：考慮到IGRA是免疫學(xué)檢測方法，營養(yǎng)不良可能會(huì)影響外周血淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)，故研究進(jìn)一步比較兩組患者不同IGRA檢測結(jié)果中的外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和T淋巴細(xì)胞亞群分布情況。

采用美國BD公司的FACSCount流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Truecount計(jì)數(shù)管和FACS溶血素進(jìn)行T細(xì)胞計(jì)數(shù)，所有試劑均在有效期內(nèi)按說明書使用。Immuno-Trol質(zhì)控血同檢測標(biāo)本一同進(jìn)行操作，在流式細(xì)胞檢測的試管中加20 μl CD4熒光標(biāo)記抗體，然后加入混勻的抗凝血50 μl，室溫避光孵育15 min。在標(biāo)本中加入溶血素，室溫避光孵育15 min 后上機(jī)檢測，上機(jī)前應(yīng)用CaliBRITETM磁珠及FACSCompTM軟件校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀，將制備好的樣本上機(jī)，使用MultiSETTM軟件獲取并自動(dòng)分析檢測結(jié)果。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用Excel 2016軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行雙錄入。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究計(jì)量資料均呈偏態(tài)分布，采用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”描述，組間差異的比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以“構(gòu)成比/百分率(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.IGRA檢測結(jié)果：IGRA檢測陽性率在兩組患者中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且檢測兩組患者中病原學(xué)陽性患者陽性率的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表2。

表2 IGRA結(jié)果在兩組患者中的分布情況

2.外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及T淋巴細(xì)胞亞群檢查結(jié)果：本研究中有T淋巴亞群檢查結(jié)果的結(jié)核病患者共計(jì)344例，其中，營養(yǎng)不良組118例，對(duì)照組226例。結(jié)果顯示，外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及T淋巴細(xì)胞亞群分布在兩組所有患者間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，并且在營養(yǎng)不良患者中IGRA陽性與IGRA陰性患者間的分布差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。具體見表3、4。

表3 淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群在兩組患者中的檢測水平

討 論

結(jié)核病是一種慢性消耗性傳染病，常伴有營養(yǎng)不良的表現(xiàn)。本研究根據(jù)BMI值將443例結(jié)核病患者分為營養(yǎng)不良組(BMI<18.5)和非營養(yǎng)不良組(BMI≥18.5)，發(fā)現(xiàn)IGRA檢測營養(yǎng)不良結(jié)核病患者的陽性率與非營養(yǎng)不良患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在病原學(xué)陽性結(jié)核病患者亞組分析中陽性率的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示IGRA檢測可以推薦用于營養(yǎng)不良患者結(jié)核病的輔助診斷。

表4 淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群在IGRA陽性與陰性營養(yǎng)不良結(jié)核病患者中的檢測水平

傳統(tǒng)的結(jié)核感染篩查方法如結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)等應(yīng)用廣泛，但敏感度和特異度均較低。而QFT-GIT是通過酶聯(lián)免疫吸附法在體外測定結(jié)核特異性抗原刺激新鮮肝素化全血中IFN-γ的濃度來判斷患者是否感染結(jié)核分枝桿菌，在早期的研究中就顯示出其診斷結(jié)核感染的敏感度約為80%[4]，已成為當(dāng)前運(yùn)用較為成熟的檢測方法。本研究使用該技術(shù)的檢測結(jié)果顯示，營養(yǎng)不良及非營養(yǎng)不良結(jié)核病患者的陽性檢出率分別為76.47%和78.18%，且在病原學(xué)陽性結(jié)核病患者中的陽性率分別為75.61%和80.65%，這說明QFT-GIT對(duì)不同營養(yǎng)狀態(tài)下結(jié)核病患者的檢測結(jié)果具有較好的一致性。而且，本研究結(jié)果高于另一研究中IGRA在營養(yǎng)不良結(jié)核病患兒中診斷結(jié)核病的陽性率(69.6%)，該研究共計(jì)納入86例疑似結(jié)核病患兒[11]，提示QFT-GIT對(duì)成年人的陽性檢出率較高，可能與兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全有關(guān)。另外，一項(xiàng)納入1928例疑似結(jié)核病患者的研究指出，高BMI可能與TB-IGRA檢測的假陰性相關(guān)[12]，但并未指出營養(yǎng)不良即低BMI與IGRA檢測結(jié)核病患者的不良結(jié)果相關(guān)。

結(jié)核分枝桿菌感染人體后，機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗是由特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。在T細(xì)胞亞群中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是機(jī)體針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫應(yīng)答中的主要細(xì)胞[13]，與外周血淋巴細(xì)胞呈線性相關(guān)，CD4+T細(xì)胞是產(chǎn)生IFN-γ的主要細(xì)胞，少量的CD8+T細(xì)胞也誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ[14]。QFT-GIT檢測法可通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答來檢測結(jié)核分枝桿菌感染情況，其檢測結(jié)果與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)密切相關(guān)。一項(xiàng)Meta分析顯示，外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低可能是IGRA假陰性的常見危險(xiǎn)因素[15]；另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者在使用免疫抑制藥物或合并HIV感染等情況時(shí)，其免疫功能極易受損，從而出現(xiàn)免疫缺陷，導(dǎo)致T細(xì)胞無法充分產(chǎn)生IFN-γ，可能降低IGRA檢測的陽性率[16]。故建議對(duì)于需要篩查的結(jié)核病高危人群，在進(jìn)行TB-IGRA 檢測的同時(shí)應(yīng)完善淋巴細(xì)胞亞型的分析[17]。另外，嚴(yán)重營養(yǎng)不良或饑餓也可以通過影響T細(xì)胞的存活和增殖來改變T細(xì)胞數(shù)量。有研究將禁食48 h后的小鼠與正常喂養(yǎng)的小鼠進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)被禁食小鼠的胸腺細(xì)胞數(shù)明顯下降[18]；另有研究在營養(yǎng)不良的細(xì)菌感染患兒中發(fā)現(xiàn)，CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于正常體質(zhì)量的細(xì)菌感染的患兒[19]。本研究顯示，外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及T細(xì)胞亞群在營養(yǎng)不良及非營養(yǎng)不良結(jié)核病患者中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在本研究中營養(yǎng)不良并未影響到淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及T淋巴細(xì)胞亞群的分布，這可能與本研究納入的研究者均為免疫系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育完全的成年人有關(guān)，這也可能是兩組患者中IGRA檢測結(jié)果未受到影響的原因。

與本研究結(jié)果類似，糖尿病患者雖然有免疫功能異常，但Walsh等[20]發(fā)現(xiàn)IGRA并未降低合并結(jié)核病的糖尿病患者的陽性檢出率，提示IGRA不僅可以用于糖尿病患者結(jié)核感染的診斷，也可以用于LTBI者的檢測。同理，本研究得出的結(jié)論也可延伸到LTBI人群，即IGRA診斷營養(yǎng)不良人群中LTBI者的敏感度不會(huì)降低，這可能與結(jié)核病患者容易發(fā)展成結(jié)核分枝桿菌特異性免疫無能，使IGRA檢測敏感度下降[21-23]，而在營養(yǎng)不良的LTBI者中并無此類免疫無能發(fā)生有關(guān)。因此，IGRA對(duì)于診斷營養(yǎng)不良患者結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的敏感度應(yīng)與IGRA輔助診斷營養(yǎng)不良疑似結(jié)核病患者的敏感度相當(dāng)或者更好。因此，IGRA用于診斷營養(yǎng)不良患者中LTBI與其他人群同樣可靠，但該推斷需要在營養(yǎng)不良和非營養(yǎng)不良LTBI者中進(jìn)行研究確定。

綜上所述，營養(yǎng)不良并不會(huì)影響不同營養(yǎng)狀態(tài)下IGRA檢測結(jié)核病的陽性率，提示IGRA在營養(yǎng)不良的結(jié)核病患者中具有與其他人群同樣的輔助診斷價(jià)值，并有可能適用于營養(yǎng)不良人群中LTBI者的篩查。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)拉巴：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)的采集與整理、初稿撰寫；張蒙蒙和王明桂：數(shù)據(jù)分析及初稿撰寫；賀建清：主導(dǎo)整個(gè)課題設(shè)計(jì)及論文初稿修改