劉盛盛 楊娟 查兆煜 張超 許子煒 唐神結 林文紅

【Fundprogram】 Scientific Research Project of Anhui Provincial Health Commission (AHWJ2021b072)

全球范圍內，結核病仍是嚴重危害人類健康的傳染病。2020年，全球新發結核病患者987萬例，發病率為127/10萬[1]。HIV陰性結核病死亡數從2019年的121萬增加到128萬[1]。宿主的免疫功能在結核病的發病、轉歸及預后方面發揮重要作用[2]。淋巴細胞通過多種功能效應在機體抵抗侵入病原菌中扮演重要角色，其中CD4+T淋巴細胞能夠分泌白細胞介素(IL)-2、γ-干擾素(IFN-γ)等細胞因子，激活巨噬細胞，提高其殺傷細菌的功能，誘導細胞免疫反應[3]。目前認為CD4+T淋巴細胞能夠減少結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis， MTB)細胞內增殖、防止感染播散和促進宿主的長期生存，在病程的各個階段均發揮重要作用[3-4]。研究發現，活動性肺結核患者外周血CD4+T淋巴細胞水平下降，且經過抗結核治療后其計數明顯上升[5-6]。因此，明確肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的影響因素，為臨床制定干預措施、判斷療效及預后等方面具有積極意義，但目前相關報道較少。本研究回顧性納入了213例肺結核患者的臨床資料，分析CD4+T淋巴細胞減少的發生率和影響因素，并觀察免疫干預對療效的影響，以期為臨床和科研工作提供一定的參考。

對象和方法

一、研究對象

根據電子病歷系統，連續納入2020年12月至2021年7月安徽省胸科醫院結核科住院的出院診斷包含肺結核的患者為研究對象。初始納入3155例，排除未行淋巴細胞亞群檢測者2896例、疑似患者22例、非結核分枝桿菌病16例、陳舊性肺結核3例、結核性胸膜炎(不伴有肺部病灶)2例、HIV感染者2例、合并免疫系統疾病1例，最終納入研究對象213例。

二、研究方法

1.診斷標準：肺結核的診斷包括確診和臨床診斷，參照《WS 288—2017肺結核診斷》[7]。本研究中僅診斷為結核性胸膜炎，未伴有肺部病灶者不納入研究。

2.相關定義：(1)耐藥結核病[8]：結核病患者感染的結核分枝桿菌在體外被證實在一種或多種抗結核藥物存在時仍能生長。(2)初治結核病[8]：符合下列情況之一：①從未因結核病應用過抗結核藥物治療的患者；②正進行標準化療方案規則用藥未滿療程的患者；③不規則化療未滿1個月的患者。(3)復治結核病[8]：符合下列情況之一：①因結核病不合理或不規則使用抗結核藥物治療≥1個月的患者；②初治失敗和復發患者。(4)肺外結核[8]：指結核病變發生在肺以外的器官和部位。(5)CD4+T淋巴細胞減少：根據本研究醫療機構該指標參考值范圍，定義為CD4+T淋巴細胞計數<410個/μl。

3.分組：根據納入時患者外周血CD4+T淋巴細胞計數分為兩組，<410個/μl為CD4+T淋巴細胞減少組，共61例；≥410個/μl為對照組，共152例。根據是否使用免疫干預治療，將CD4+T淋巴細胞減少患者分為兩組，免疫干預組(33例)和非免疫干預組(28例)。其中非免疫干預組采用常規化學治療，干預組在常規治療基礎上加用胸腺肽口服。

4.淋巴細胞亞群檢測：使用BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀及配套檢測試劑盒。主要步驟如下：(1)使用EDTA抗凝管采集研究對象外周靜脈血約3 ml；(2)24 h內，20 μl的熒光單克隆抗體加入50 μl靜脈血標本渦旋混勻，室溫避光孵育15 min；(3)向上述混合物中加入450 μl的溶血素，渦旋混勻，室溫避光孵育10 min；(4)上機自動檢測。

5.觀察指標：收集研究對象的人口學特征(性別、年齡、職業、文化水平)、吸煙、飲酒、癥狀數目、治療分類、合并疾病、耐藥情況、影像及實驗室檢查結果等臨床資料。收集CD4+T淋巴細胞減少患者治療7個月期間的復查資料，包括痰涂片、培養及影像資料等，評估其療效。影像評估標準：(1)病灶范圍變化：①全吸，病灶全部吸收；②顯吸，原病灶吸收≥1/2；③吸收，原病灶吸收<1/2；④不變，原病灶無明顯變化；⑤惡化，原病灶擴大或播散。(2)空洞變化：①閉合：治療后空洞閉合；②縮?。褐委熀罂斩纯s小≥1/2原空洞直徑；③增大：治療后空洞增大>1/2原空洞直徑。

三、統計學處理

結 果

一、研究對象一般資料

共納入研究對象213例，其中男性139例(65.3%)，女性74例(34.7%)；年齡范圍14～89歲，年齡M(Q1,Q3)為46(29，58)歲；職業以待業/家務/退休和農民最多，分別為60例(28.2%)和52例(24.4%)；文化水平以中學/職專最多，為85例(39.9%)；吸煙者52例(24.4%)；飲酒者21例(9.9%)；并發糖尿病者36例(16.9%)；并發惡性腫瘤者9例(4.2%)；初治肺結核134例(62.9%)，復治肺結核79例(37.1%)；合并肺外結核者53例(24.9%)；耐藥肺結核55例(25.8%)。

二、研究對象外周血T淋巴細胞亞群分析

CD3+T淋巴細胞占比M(Q1,Q3)為72.78%(66.19%，77.82%)；CD4+T淋巴細胞占比平均值為(41.78±9.34)%；CD8+T淋巴細胞占比M(Q1,Q3)為26.44%(21.52%，33.98%)；CD3+T淋巴細胞計數M(Q1,Q3)為943.21(661.00，1253.71)個/μl；CD4+T淋巴細胞計數M(Q1,Q3)為546.08(382.44，739.69)個/μl；CD8+T淋巴細胞計數M(Q1,Q3)為350.00(228.50，489.23)個/μl；CD4/CD8比值M(Q1,Q3)為1.57(1.13，2.12)。CD4+T淋巴細胞減少患者共61例，發生率為28.6%。

三、免疫干預組與非免疫干預組治療不同階段的效果比較

免疫干預組和非免疫干預組以入院開始治療時間為基線，治療2～4個月，免疫干預組痰涂片陰性率高于非免疫干預組，差異有統計學意義(P<0.05)，免疫干預組痰培養陰性率高于非免疫干預組，但差異無統計學意義(P>0.05)。治療5～7個月，免疫干預組痰涂片陰性率高于非免疫干預組，但差異無統計學意義(P>0.05)；免疫干預組痰培養陰性率低于非免疫干預組，但差異無統計學意義(P>0.05)。治療5～7個月，免疫干預組空洞縮小率高于非免疫干預組，但差異無統計學意義(P>0.05)，免疫干預組病灶吸收率優于非免疫干預組，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者治療不同階段的效果比較

四、CD4+T淋巴細胞減少的單因素分析

單因素分析結果：CD4+T淋巴細胞減少組男性、年齡≥60歲、農民職業、文盲、癥狀數目≥4個、并發肺外結核、累及肺野4～6個、肺部空洞、血紅蛋白<110 g/L、血小板<125×109/L、白蛋白<35 g/L、CD8+T淋巴細胞計數<190個/μl的構成比(77.0%、44.3%、36.1%、26.2%、36.1%、34.4%、77.0%、55.7%、45.9%、18.0%、68.9%、29.5%)明顯高于對照組(60.5%、11.2%、19.7%、10.5%、19.7%、21.1%、38.2%、40.8%、25.7%、5.3%、44.7%、7.9%)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的單因素分析

續表2

續表2

五、CD4+T淋巴細胞減少的多因素分析

以CD4+T淋巴細胞是否減少作為因變量，將單因素分析中差異有統計學意義的因素作為自變量進行多因素logistic回歸分析，各因素賦值見表3。結果顯示：年齡≥60歲、累及肺野4～6個、血小板<125×109/L、CD8+T淋巴細胞計數<190 個/μl是肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的危險因素，見表4。

表3 多因素logistic回歸分析變量賦值表

表4 肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的多因素logistic回歸分析

討 論

CD4+T淋巴細胞在結核病的免疫保護性反應中起著重要作用，其減少可能會導致感染的播散及不良預后[3]。在本研究中，我們回顧性分析了HIV陰性肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的發生率、影響因素及免疫干預對療效的影響。

既往關于HIV陰性結核病患者中CD4+T淋巴細胞減少發生率的報道較少，且結果不一致。Skogmar等[9]和Baluku等[10]研究發現CD4+T淋巴細胞減少發生率分別為24.7%和25.0%，與本研究的28.6%較為接近。Kony等[11]和Jones等[5]報道的發生率分別為14.4%和43.5%，與本研究差別較大。造成差異的原因可能與研究對象的種族、地域、樣本量及CD4+T淋巴細胞減少界值的不同有關，尚需進行多中心、大樣本研究進一步探討。本研究28.6%的CD4+T淋巴細胞減少發生率仍提示相當一部分肺結核患者對抗MTB感染的免疫功能受損，這可能導致感染播散和療效不佳，應予以足夠的重視。本研究61例CD4+T淋巴細胞減少患者中，28例行常規治療，33例在常規治療的基礎上進行了免疫干預治療，盡管治療后痰培養陰性率兩組差異無統計學意義，但在治療2～4個月干預組患者的痰涂片陰性率更高，這說明對CD4+T淋巴細胞減少肺結核患者進行免疫干預，能夠加快患者的痰菌陰轉，對控制疾病的傳播具有積極意義。此外，治療5～7個月時，干預組患者的肺部病灶吸收情況亦優于對照組。因此，及時對肺結核患者進行CD4+T淋巴細胞檢測，輔助評價其免疫狀況，合理進行免疫干預對提高療效和改善預后具有重要價值。

我國第五次結核病流行病學抽樣調查發現，老年肺結核患者的占比高達48.8%[12]。成詩明等[13]研究發現，老年痰涂片陽性(涂陽)肺結核患病率是其他年齡組平均涂陽患病率的3.6倍，占全國涂陽患者例數的28.6%。此外，老年肺結核患者治療有效率低，不良反應發生率和病死率高[14]，因此對老年肺結核的診治已成為結核病防治工作的重點和難點。本研究中，60歲及以上的老年患者發生CD4+T淋巴細胞減少的幾率是其余患者的4.816倍，與鄒莉萍等[15]研究結論相似。可能的原因是隨著年齡增長，人體T淋巴細胞增殖功能減退。本研究表明肺結核患者的CD4+T淋巴細胞水平與年齡相關，老年患者更易出現CD4+T淋巴細胞減少和免疫功能受損。這也是老年患者療效和預后欠佳的重要原因之一。因此，建議臨床上對老年肺結核患者進行CD4+T淋巴細胞檢測，了解其免疫狀況，及時進行干預治療，以更好地控制結核病的流行。

我們發現CD4+T淋巴細胞計數與患者病變范圍相關，病變累及4～6個肺野的患者CD4+T淋巴細胞減少的幾率約為病變累及1～3個肺野的3.669倍，與其他學者的研究結論一致[6, 16]。這提示隨著肺部病變嚴重程度的增加，CD4+T淋巴細胞減少的風險增大，機體抗MTB的保護性防御機制下降?？赡芤驗榉尾坎∽兎秶^大者外周血T淋巴細胞在肺組織嚴重感染部位積聚，而外周血中T淋巴細胞的數量相對減少[17]。具體機制還需要進一步研究明確。對于肺部病變范圍較大的肺結核患者，需考慮CD4+T淋巴細胞減少和機體免疫狀態的惡化。

血小板是宿主調節炎癥反應的關鍵效應細胞之一，參與局部和全身炎癥過程的啟動和傳遞[18]。血小板通過分泌化學誘導劑趨化因子配體5(CCL5)刺激T淋巴細胞黏附，從而調節T淋巴細胞功能[19]。本研究發現，血小板減少是HIV陰性肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的獨立危險因素，這與Li等[6]研究結論一致。提示血小板減少的肺結核患者，臨床上需考慮CD4+T淋巴細胞減少可能。但目前鮮有肺結核患者血小板和CD4+T淋巴細胞存在相關性的報道，尚無法明確兩者之間的具體影響機制，值得進一步探索。

早期觀點認為在宿主對MTB的免疫應答中，CD8+T淋巴細胞的作用不大，但之后研究逐漸發現CD8+T淋巴細胞亦發揮著重要而復雜的作用[20-21]。它可以通過分泌穿孔素、顆粒酶等物質直接殺死MTB，并可通過Fas/FasL途徑誘導細胞凋亡[22-23]。病情越嚴重，CD8+T淋巴細胞計數下降越明顯[16]。這表明機體調動CD8+T淋巴細胞直接殺傷MTB而導致其細胞耗竭，提示機體免疫狀態的惡化。CD4+T淋巴細胞是CD8+T淋巴細胞增殖所必需的[24]，它們間的效應機制可有助于MTB感染的控制[3]。本研究發現CD8+T淋巴細胞減少患者CD4+T淋巴細胞減少的風險約增大到3.908倍，這提示CD8+T淋巴細胞減少者往往伴隨CD4+T細胞的減少，該類人群的免疫功能更加紊亂，可能預示著病情加重或預后不良，需及時抗菌治療和免疫干預。

有學者發現其他一些因素也與肺結核患者外周血CD4+T淋巴細胞相關，如翟慧等[25]發現初治和復治患者之間、有無空洞及空洞占肺野數之間CD4+T淋巴細胞表達率存在統計學差異。本研究中未觀察到上述結果，可能因為本研究采用的是細胞絕對計數分析，而不是表達率。當然，后續將擴大樣本量全面探討外周血T淋巴細胞亞群與上述指標的相關性。關于耐藥方面，有報道肺結核患者CD4+T淋巴細胞表達率不隨耐藥程度加重而變化[26-27]，但何綱等[27]發現耐多藥肺結核患者CD4+T淋巴細胞絕對計數低于敏感患者。我們發現CD4+T淋巴細胞減少組和對照組耐藥患者構成比無明顯差異，可能因為耐藥的范圍不同。本研究的耐藥患者是對任何一種抗結核藥物耐藥者，而何綱等[27]的研究人群為耐多藥患者。此外，有研究發現，貧血[10]、白蛋白降低[5]的結核病患者更易發生CD4+T淋巴細胞減少。我們在單因素分析中發現貧血和白蛋白降低在CD4+T淋巴細胞減少組和對照組中確實存在統計學差異，但多因素分析中由于其他因素的綜合影響，顯示該兩項指標不是CD4+T淋巴細胞減少的獨立危險因素，后續仍需大樣本及分層分析進一步探索。

本研究亦存在一定的局限性。首先，本次為回顧性研究，且對象均為住院患者，存在一定的選擇偏倚，需要前瞻性、大規模研究驗證結論。其次，沒有動態監測治療后患者外周血T淋巴細胞亞群變化，后續擬根據患者治療時間動態監測該指標，以進一步驗證該指標對療效和預后的判斷價值。

綜上所述，HIV陰性肺結核患者具有較高的CD4+T淋巴細胞減少發生率。免疫干預治療對提高該類人群療效具有積極意義。高齡、肺部病變累及范圍大、血小板減少和CD8+T淋巴細胞減少均是肺結核患者CD4+T淋巴細胞減少的危險因素。因此，臨床上對具有上述危險因素的患者進行CD4+T淋巴細胞檢測，評估其免疫功能，有助于給予合理的免疫干預治療，以提高療效和改善預后。

志謝衷心感謝安徽省胸科醫院倪敏敏、姚婷對本研究臨床資料的錄入及校對！

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻劉盛盛：采集數據、統計分析、論文撰寫和修改；楊娟：采集數據,論文撰寫；查兆煜、張超、許子煒：采集數據; 唐神結、林文紅：研究設計，指導論文撰寫和修改