食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的優(yōu)化

王 樂，陳 佳，秦 麗

（1.張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北張家口 075000；2.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊 050035；3.河北省知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)中心，河北石家莊 050000）

沙門氏菌（Salmonella）是一種最常見的、能引起人畜共患病的食源性致病菌，在人和動物體中有廣泛的寄主[1]。我國由沙門氏菌引起的食源性疾病居細(xì)菌性食源性疾病的首位[2]。在消費(fèi)者食用被沙門氏菌污染的食物后，會出現(xiàn)腹瀉、腸胃炎、發(fā)熱和敗血癥等一系列癥狀[3]。

近年來，隨著生活水平的提高，人們對食品安全問題的重視日益增加。食品中富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，是食源性致病菌生長、繁殖的良好基質(zhì)，而且食品在加工、包裝、配送及儲存等過程中也極易受到食源性致病菌污染[4]。因此，加強(qiáng)對食品中食源性致病菌的檢測就顯得十分重要。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，沙門氏菌在食源性致病菌中排名第一，世界各國對于食品中沙門氏菌的檢測要求都十分嚴(yán)格，沙門氏菌污染一直是食品行業(yè)檢測的重要指標(biāo)之一[5]。

目前，沙門氏菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法和PCR法[6-8]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多重PCR法、實(shí)時(shí)熒光PCR法、側(cè)向流動檢測法等一系列新方法也逐步開始應(yīng)用于食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)[9-11]。但傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代檢測技術(shù)都必須以目標(biāo)菌的富集為前提，從而進(jìn)行后續(xù)的檢測[12]。前增菌過程可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的富集，是縮短增菌時(shí)間、降低背景干擾的有效手段[13]。沙門氏菌現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法的前增菌是采用緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基使樣品中菌體恢復(fù)并大量增殖的過程，此步驟對后續(xù)檢出率的影響至關(guān)重要，但其所需的檢測時(shí)間較長[14]。因此，本研究以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過酵母添加量的優(yōu)化，以期得到一種快速、特異性強(qiáng)的培養(yǎng)基，從而縮短前增菌時(shí)間，為我國食品安全的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實(shí)驗(yàn)所用的鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50976）購于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

酵母浸膏（Becton，Dickinson and Company）；磷酸鹽緩沖液、營養(yǎng)瓊脂、緩沖蛋白胨水、平板計(jì)數(shù)瓊脂（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×PCR Master Mix（天根生化科技北京有限公司）；引物及探針（生工生物工程上海股份有限公司）。

二級生物安全柜；多功能酶標(biāo)儀（Synergy HTX）；恒溫培養(yǎng)箱（PHCbi）；電子天平（ME4002E）；Sigma 3K15冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；LightCycler 480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國羅氏診斷有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

把-80 ℃保存的鼠傷寒沙門氏菌CMCC50976加入到無菌磷酸鹽緩沖液中，挑取菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，36 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)一次。挑取活化好的單菌落接種于磷酸鹽緩沖液中，振蕩均勻，將菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫瓤刂圃?.5～0.6。對上述菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取100 μL菌懸液接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。菌懸液的濃度為 7.7×106CFU/mL。

1.3.2 酵母浸膏添加量的篩選

以緩沖蛋白胨水為基礎(chǔ)，分別添加終濃度為0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和11 g/L的酵母浸膏，每瓶分裝100 mL，高壓滅菌。對添加不同濃度酵母浸 膏（0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和 11 g/L）的改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基接種1 mL 1.3.1中濃度為7.7×10-6CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌。空白培養(yǎng)基作為對照，與接種后的培養(yǎng)基同時(shí)放入36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.3 沙門氏菌OD550值的測定

沙門氏菌菌懸液培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后，分別用酶標(biāo)儀測量550 nm波長下空白培養(yǎng)基和菌懸液的OD550值。以O(shè)D550值的大小衡量沙門氏菌生物量的多少，篩選出最佳酵母浸膏的添加量。

1.3.4 沙門氏菌平板計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證

同時(shí)吸取1 mL菌懸液，10倍梯度稀釋后接種在平板計(jì)數(shù)瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR法的特異性驗(yàn)證

采用試劑盒法對培養(yǎng)10 h后酵母浸膏濃度為9 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液進(jìn)行DNA模板的提取，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法驗(yàn)證其特異性。試驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置陽性對照（沙門氏菌菌懸液基因組DNA），陰性對照（其他菌菌懸液基因組DNA）和空白對照（添加無菌水）。

實(shí)時(shí)熒光PCR法引物序列為P1：5'-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3'；P2：5'AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3'。實(shí)時(shí)熒光PCR法探針序列為“FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMARA”。最終反應(yīng)體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL；上下游引物各 0.5 μL；探針 0.5 μL；DNA 模板 5 μL；雙蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；65 ℃，30 s；40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線測定結(jié)果

由圖1可知，沙門氏菌菌懸液OD550值隨生長時(shí)間增加呈現(xiàn)上升的趨勢，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)24 h前沒有出現(xiàn)衰亡期。添加酵母浸膏的改良緩沖蛋白胨水菌懸液，培養(yǎng)2 h后均結(jié)束調(diào)整期，進(jìn)入對數(shù)增長期；緩沖蛋白胨水菌懸液，培養(yǎng)4 h后，才結(jié)束調(diào)整期，進(jìn)入對數(shù)增長期。從整體趨勢分析，改良緩沖蛋白胨水的增菌速度明顯高于緩沖蛋白胨水，沙門氏菌在添加酵母浸膏的培養(yǎng)基中能夠更快地恢復(fù)活性。隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母添加量的增加，對數(shù)期斜率和穩(wěn)定期數(shù)值基本呈增大的趨勢。

圖1 沙門氏菌生長曲線

2.2 平板計(jì)數(shù)測定的驗(yàn)證結(jié)果

由表1可知，不同酵母浸膏添加量的緩沖蛋白胨水菌懸液平板計(jì)數(shù)測定結(jié)果與OD550值的變化趨勢基本相同，沙門氏菌的數(shù)量隨時(shí)間增加呈現(xiàn)上升的趨勢，與2.1中OD550值的變化趨勢一致。

表1 不同酵母浸膏添加量平板計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 沙門氏菌第8 h和第18 h OD550值的比較

由圖2可知，在第8 h，緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值最低，酵母浸膏添加量為3 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值是其3倍。說明酵母浸膏的添加可以促進(jìn)沙門氏菌的生長。隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏添加量的增加，菌懸液的OD550值呈緩慢增長趨勢，不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值沒有顯著差異。在第18 h，緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值最低，隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏添加量的增加，菌懸液的OD550值逐步增加，差異顯著。酵母浸膏添加量為11 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值達(dá)到0.38。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）規(guī)定的預(yù)增菌時(shí)間為8～18 h。因此，增加緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏的添加量可以使菌懸液提前達(dá)到所需的OD550值，從而縮短前增菌時(shí)間。

圖2 沙門氏菌第8 h和第18 h OD550值的比較

2.4 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏添加量的篩選結(jié)果

由于在第8 h不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值沒有顯著差異，而在第18 h不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值差異顯著。因此，根據(jù)第18 h菌懸液的OD550值篩選緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏的添加量。由表2可知，第18 h緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值為0.11。酵母浸膏添加量為3 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第16 h可超過此OD550值；酵母浸膏添加量為5 g/L和7 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第12 h可超過此OD550值；酵母浸膏添加量為9 g/L和11 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第10 h可超過此OD550值。從經(jīng)濟(jì)成本考慮，酵母浸膏的添加量為9 g/L是最佳培養(yǎng)基配比。該改良培養(yǎng)基能充分提供食品中沙門氏菌恢復(fù)、生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，使沙門氏菌的前增菌時(shí)間縮短到8～10 h。

表2 第10～18 h不同酵母浸膏添加量緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值

2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR法的特異性驗(yàn)證結(jié)果

如圖3所示，酵母浸膏添加量為9 g/L的改良緩沖蛋白胨水對食品中沙門氏菌特異性良好，可以實(shí)現(xiàn)食品中沙門氏菌的快速檢測。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR法擴(kuò)增曲線

3 結(jié)論與討論

食源性致病菌的檢測是食品安全監(jiān)管的重要環(huán)節(jié)。沙門氏菌污染造成的食品安全事件時(shí)有發(fā)生，通常在感染沙門氏菌后12～72 h內(nèi)出現(xiàn)臨床癥狀，主要包括惡心、頭痛、嘔吐、發(fā)燒、腹痛和腹瀉等[15-16]。因此，從食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)加強(qiáng)對食源性致病菌的檢測顯得至關(guān)重要。

培養(yǎng)基為微生物生長提供了適合的環(huán)境條件和所需的營養(yǎng)物質(zhì)，微生物前增菌是影響微生物檢測的重要因素[17]。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者已對培養(yǎng)基的優(yōu)化開展了多種研究[18]。本研究以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過添加酵母浸膏促進(jìn)沙門氏菌的恢復(fù)和生長。研究表明，隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母添加量的增加，沙門氏菌的調(diào)整期縮短，對數(shù)期斜率和穩(wěn)定期數(shù)值呈增大的趨勢。調(diào)整期縮短表示沙門氏菌在添加酵母浸膏情況下恢復(fù)能力增強(qiáng)，可以更快地適應(yīng)環(huán)境；對數(shù)期斜率增大表示沙門氏菌的生物量的增速加大，該培養(yǎng)基的配比適合沙門氏菌的生長。吸光度法測定沙門氏菌的生長曲線沒有出現(xiàn)下降的趨勢，因?yàn)槲舛确ㄖ荒軠y出細(xì)菌總數(shù)，而不是活菌數(shù)量。因此，本研究通過平板計(jì)數(shù)法與之對比，結(jié)果表明吸光度法和平板計(jì)數(shù)法測定的生長曲線基本一致，這說明培養(yǎng)基中營養(yǎng)比較豐富，沙門氏菌沒有達(dá)到衰亡期。食品中沙門氏菌在酵母浸膏添加量為9 g/L的改良緩沖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h后，菌懸液的OD550值達(dá)到0.13，超過其在緩沖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后達(dá)到的OD550值，改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的前增菌時(shí)間縮短了8 h。通過實(shí)時(shí)熒光PCR法的驗(yàn)證，確定該改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基特異性良好，可以滿足目標(biāo)菌的檢測要求。因此，食品中沙門氏菌的前增菌時(shí)間可以縮短到 8～ 10 h。

本研究優(yōu)化了食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的配比，通過添加酵母浸膏縮短了前增菌所需的檢驗(yàn)時(shí)間，滿足了快速檢測的需求，為我國食品檢驗(yàn)工作提供了參考。在加工過程中，食品中的微生物可能會受到高溫或低溫的損傷，處于難培養(yǎng)或活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but Non-Culturable，VBNC）[19]。當(dāng)食源性致病菌進(jìn)入這一狀態(tài)后，將無法采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，但該致病菌仍能存活，這種現(xiàn)象會對食品安全構(gòu)成潛在的威脅。因此，本研究下一步的研究方向?qū)剿髋囵B(yǎng)基對微生物菌體損傷的修復(fù)能力，為食源性致病菌的檢測提供更可靠的依據(jù)。